[发明专利]一种LRFFT2细胞的构建方法在审
| 申请号： | 201910438800.4 | 申请日： | 2019-05-24 |
| 公开（公告）号： | CN110205341A | 公开（公告）日： | 2019-09-06 |
| 发明（设计）人： | 焦顺昌;张嵘;张天赋;周子珊;解佳森;吴子明;彭刚 | 申请（专利权）人： | 北京鼎成肽源生物技术有限公司;焦顺昌 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N5/10 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 102200 北京市昌平区双*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | 本发明提供一种LRFFT2细胞的构建方法，使用人源外周血进行ctDNA测序或肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点进行抗原表位预测，连接并合成突变多肽表达基因序列；同时构建慢病毒载体，包装慢病毒，转染APC细胞，完成特异性LV细胞的改造，体外与从外周血中分离的PBMC共培养，筛选出有效多肽，通过精准有效多肽刺激的第二次冲击，将普通T细胞改造成为具有更精准杀伤能力的RFF细胞；再利用TCR－T技术原理进行了改造；改造后的T细胞在体外用抗体药物进行免疫抑制性信号的封闭，精准的保护了特异性杀伤T细胞免受体内抑制，提高了T细胞对肿瘤细胞的杀伤力，得到更为攻防兼备的LRFFT2细胞。LRFFT2细胞可广泛应用于个体化精准治疗实体肿瘤。 | ||
| 搜索关键词： | 细胞 构建 外周血 多肽 改造 抗原表位预测 治疗实体肿瘤 筛选 慢病毒载体 免疫抑制性 特异性杀伤 外显子测序 表达基因 技术原理 抗体药物 杀伤能力 体内抑制 突变多肽 突变位点 肿瘤细胞 肿瘤组织 个体化 慢病毒 体外用 再利用 测序 体外 转染 合成 刺激 封闭 应用 | ||
【主权项】：
1.一种LRFFT2细胞的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括如下步骤：1)通过测序肿瘤细胞筛选出突变位点，以突变的氨基酸位点为中心，向两侧各延伸8个氨基酸，将这段17个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位，使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50，如IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位；2)使用上步软件分析任意抗原表位两两相连后接头处的IC50，IC50≥1000nM时认为是弱免疫原性，将弱免疫原性的抗原表位连接在一起，合成连接后的突变多肽的基因序列；3)构建表达突变多肽的慢病毒载体，包装慢病毒；4)使用所述慢病毒转染抗原递呈细胞并与PBMC共培养，获得LFF细胞；5)所述突变多肽作为抗原刺激所述LFF细胞，通过检测IFN‑γ的分泌，筛选出有效的精准多肽；6)以所述精准多肽作为抗原刺激所述LFF细胞，对刺激后的细胞进行CD8、CD137、IFN‑γ的染色，并以流式细胞仪进行分选，筛选出能够识别所述精准多肽的特异性细胞，测序并得到特异性细胞的高频TCR基因；7)利用CRISPR技术敲除外周血T细胞中原有的TCR基因，转入上步获得的能够与精准多肽特异性结合的TCR基因，获得TCR‑T细胞；8)细胞表面免疫抑制性信号分子经抗体药物体外封闭，即得LRFFT2细胞。
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- 2019-03-25 - 2019-07-05 - C12N15/90
- 本发明公开了一种基因编辑系统及其在新金色分枝杆菌中的应用，属于基因工程技术领域以及生物工程技术领域。此系统可达到对新金色分枝杆菌进行基因编辑的目的，其工作机制如下：先将pML‑Cpf1质粒导入新金色分枝杆菌中，使得pML‑Cpf1质粒上的Cpf1基因、编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因表达，然后将pJM‑crRNA质粒导入新金色分枝杆菌中，使得pJM‑crRNA质粒转录生成crRNA序列，crRNA序列会与Cpf1基因结合形成复合物，此复合物会靶向并切割需编辑基因使得新金色分枝杆菌中需编辑的基因被敲除。
- 一种对地贫患者的造血干细胞进行基因修正的方法-201910308856.8
- 陈相波;应荣;田朋飞;雷鸣 - 杭州荣泽基因科技有限公司
- 2019-04-17 - 2019-07-05 - C12N15/90
- 本发明公开了一种对地贫患者的造血干细胞进行基因修正的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，在HBB基因‑28(A/G)位点附近选择CRISPR靶点，设计gRNA序列；步骤二，构建一个模版质粒，在HBB基因CRISPR靶点上下游两段500bp序列之间插入piggyBac的双ITRs序列；步骤三，用转染试剂、模版质粒、gRNA和Cas9载体共同转染地贫患者造血干细胞，再对细胞培养基进行嘌呤霉素筛选；步骤四，对抗性基因进行鉴定和验证；本发明将CRISPR/Cas9系统和piggyBac联合使用，可以有效地转染地贫患者的造血干细胞，提高同源重组的效率，有效地对地贫患者的‑28(A/G)突变位点进行修正。
- 一种基因敲除选育mir196a基因缺失型斑马鱼的方法-201910158021.9
- 谢华平;曾婷;谢缤灵;付贵芳;袁春燕;陈湘定;印遇龙 - 湖南师范大学
- 2019-03-02 - 2019-06-18 - C12N15/90
- 本发明涉及基因敲除技术领域，特别是公开了一种基因敲除选育mir196a基因缺失型斑马鱼的方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的mir196a基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性sgRNA和Cas9‑mRNA，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养36小时后，通过选取胚胎进行基因型分析，从而证实了所选位点的有效性。本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中敲除特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因。且干扰掉mir196a基因，并且通过遗传学手段研究其功能，有助于进一步揭示肠道形态发生的整个过程以及调控这些过程的分子机制，在医学上肠道疾病病理的理解和新的治疗方案的研发中具有十分重要的意义。
- 用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA及质粒DNA和体外转录方法-201910198850.X
- 张力;李政 - 张力;李政
- 2019-03-15 - 2019-06-11 - C12N15/90
- 本发明涉及基因工程中的基因编辑技术领域，具体涉及一种用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA及质粒DNA和体外转录方法。该cas9转录模板DNA具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列。本发明围绕CRISPR/Cas9技术在模式动物果蝇中的应用，提供了一种优化的Cas9的表达载体，显著地提高了基因编辑效率，也为其在其他领域的应用奠定了基础。
- 一种构建桔小实蝇白眼品系的方法-201810675973.3
- 颜日辉;赵三涛;刘焱晖;刘中更;刘向蕊;郉增珠 - 海南大学
- 2018-06-27 - 2019-06-11 - C12N15/90
- 本发明公开了一种构建桔小实蝇白眼品系的方法，将Cas9 mRNA与靶基因gRNA混合后，利用显微注射的方式，注射到胚胎中，再经过遗传杂交获得桔小实蝇白眼品系。本发明考虑了最佳的研究步骤和技术参数，构建了桔小实蝇白眼品系的基因编辑方法，快速、准确地获得稳定遗传的纯合桔小实蝇白眼品系，填补了技术空白，为桔小实蝇的生物学研究提供了理想的实验材料及研究思路，具有良好的应用前景。
- CRISPR-Cas9系统介导的小鼠FGF5基因敲除的方法-201711145330.X
- 郭旭东;白宇;张晓枫;张蒙;梁浩 - 内蒙古大学
- 2017-11-19 - 2019-05-28 - C12N15/90
- 本发明是根据小鼠FGF5基因序列，构建基于CRISPR‑Cas9系统的sgRNA表达载体，将sgRNA和Cas9 质粒混合物对受精卵原核注射，胚胎移植，品系基因鉴定，得到基因突变鼠，并pcr测序，确认最终得到遗传性小鼠突变模型。本发明构建的CRISPR‑Cas9介导的打靶载体为小鼠FGF5基因的敲除提供了一种简便快速安全的途径，该方法实现了不添加任何筛选标记即可筛选定点整合外源基因细胞系，大大提高了转基因动物的安全性，对小鼠的遗传育种具有重要价值。
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