[发明专利]用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA及质粒DNA和体外转录方法在审

专利信息
申请号: 201910198850.X 申请日: 2019-03-15
公开(公告)号: CN109868288A 公开(公告)日: 2019-06-11
发明(设计)人: 张力;李政 申请(专利权)人: 张力;李政
主分类号: C12N15/90 分类号: C12N15/90;C12N9/22;C12N15/66;A01K67/033
代理公司: 北京思创大成知识产权代理有限公司 11614 代理人: 高爽
地址: 102200 北京市昌*** 国省代码: 北京;11
权利要求书: 查看更多 说明书: 查看更多
摘要: 发明涉及基因工程中的基因编辑技术领域,具体涉及一种用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA及质粒DNA和体外转录方法。该cas9转录模板DNA具有如SEQ ID NO:1所示的碱基序列。本发明围绕CRISPR/Cas9技术在模式动物果蝇中的应用,提供了一种优化的Cas9的表达载体,显著地提高了基因编辑效率,也为其在其他领域的应用奠定了基础。
搜索关键词: 转录 模板DNA 果蝇 体外转录 质粒DNA 转基因 表达载体 基因工程 碱基序列 模式动物 基因 应用 优化
【主权项】:
1.一种用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA,其特征在于,该cas9转录模板DNA具有如SEQ ID NO:1所示的碱基序列。
下载完整专利技术内容需要扣除积分,VIP会员可以免费下载。

该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于张力;李政,未经张力;李政许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服

本文链接:http://www.vipzhuanli.com/patent/201910198850.X/,转载请声明来源钻瓜专利网。

同类专利
  • 一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡KPNA3基因的细胞系及其构建方法-201910455249.4
  • 叶建强;谢泉;李拓凡;万志敏;邵红霞;秦爱建 - 扬州大学
  • 2019-05-29 - 2019-11-08 - C12N15/90
  • 本发明涉及到一种利用CRISPR‑Cas9特异性靶向获得敲除鸡KPNA3基因的细胞系及其构建方法,本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理的构建了靶向鸡KPNA3基因的sgRNA,之后转染带有sgRNA和Cas9基因的lentiCRISPR v2质粒,利用CRISPR‑Cas9系统达到基因沉默,通过药物筛选杀死阴性细胞,随后通过亚克隆的方法获得单个细胞株,从而获得鸡源KPNA3敲除的细胞系。通过本发明,本发明基于CRISPR‑Cas9靶向敲除鸡KPNA3基因的细胞系构建在相关领域未见报道,本发明将填补国内外相关技术的空白,具有较大的应用研究价值。
  • 一种基因敲除选育pdlim5a基因缺失型斑马鱼的方法-201910445598.8
  • 邓云;陈坤;曾宇茜;欧阳诗;刘然 - 湖南师范大学
  • 2019-05-27 - 2019-10-15 - C12N15/90
  • 本发明涉及基因敲除技术领域,特别是公开了一种基因敲除选育pdlim5a基因缺失型斑马鱼的方法,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,在斑马鱼的pdlim5a基因上设计合适的打靶位点,在体外合成的特异性gRNA和Cas9‑蛋白,显微共注射进入斑马鱼一细胞内,胚胎培养48h后,通过选取胚胎进行基因型分析,从而证实了所选位点的有效性。本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因,且制作简单、成本低,且可同时对靶基因上多个位点进行剪切,沉默任意数目的单个基因。且干扰掉pdlim5a基因斑马鱼胚胎出现明显的发育畸形。
  • 一种高效快速筛选基因调控区域中功能位点的方法及应用-201910601762.X
  • 亢庆铮;亢梦晓;王福芳;张亮 - 亢庆铮
  • 2019-07-05 - 2019-10-15 - C12N15/90
  • 本发明公开了一种高效快速筛选基因非编码调控区域中功能位点的方法及应用。本发明将Cre/lox和CRISPR/Cas9技术结合,将体外构建外源突变引入到基因组内,达到原位突变的效果,从而来对基因非编码区域(如增强子等)的功能位点进行高效和快速的筛选。通过CRISPR/Cas9技术在基因组中调控区域引入点突变,虽然可以达到原位突变的效果,但其后期筛选的工作量大,另外有些突变位点的并不适合sgRNA的设计,受PAM序列的区域限制。本发明突破了上述限制,可在基因调控区域内任意位点进行点突变。另外本技术可同时引入两个或多个位点的突变,以及基因调控区域内特定序列的切除,大大降低了基因非编码调控区域研究的难度。
  • 一种双重gRNA的基因表达元件及其构建方法与应用-201910606977.0
  • 徐峰;蒋凤娟;沈小鹏;朱国萍;吴深;张静宜;李蒙 - 安徽师范大学
  • 2019-07-06 - 2019-10-15 - C12N15/90
  • 本发明公开了一种双重gRNA的基因表达元件及其构建方法与应用,涉及gRNA基因工程技术领域,双重gRNA的基因表达元件包括如下结构:多克隆酶切位点I‑U6启动子‑gRNA特异性序列1‑结构序列‑中间连接序列‑U6启动子‑gRNA特异性序列2‑结构序列‑多克隆酶切位点III,设计的双重gRNA全套基因表达元件两端各有一处多克隆酶切位点,这些酶切位点方便之后与表达载体进行连接,且表达载体不受限制,因此可以将此双重gRNA全套基因表达元件直接连接到Cas9核酸酶表达载体中,以进一步提高转染效率与基因编辑的成功率,中间存在多克隆酶切位点,可利用这些酶切位点将双重gRNA系统“拆分成”两个单gRNA系统,由此构建各种动物模型。
  • 一种高效快速构建猪肠道冠状病毒重组病毒的方法-201910626337.6
  • 肖少波;方六荣;彭棋;王荡;方谱县;周艳荣;刘康 - 华中农业大学
  • 2019-07-11 - 2019-10-15 - C12N15/90
  • 本发明属于动物传染病防制技术领域。具体涉及一种高效快速构建猪肠道冠状病毒重组病毒的方法。利用CRISPR/Cas9系统对含有PEDV AJ1102株全长cDNA的BAC质粒进行切割,再通过同源重组方式获得EGFP基因替换PEDV AJ1102株ORF3基因的重组BAC质粒,转染细胞后拯救出重组病毒rAJ1102‑△ORF3‑EGFP。由于不同的猪肠道冠状病毒具有相似的基因组结构与复制策略,本发明也适合于其它猪肠道冠状病毒重组病毒的构建。与传统方法相比,本发明具有靶点选择宽泛,特异性强,操作简单,效率高和实验周期短等突出优点,在一周之内便可获得重组病毒,是一种高效快速构建猪肠道冠状病毒重组病毒的方法。
  • 基于CRISPR-Cas9系统构建不育小鼠模型的方法-201910632746.7
  • 王全新 - 辽宁长生生物技术股份有限公司
  • 2019-07-14 - 2019-10-08 - C12N15/90
  • 本发明属于基因工程领域,具体涉及基于CRISPR‑Cas9系统构建不育小鼠模型的方法。本发明的基于CRISPR‑Cas9系统构建不育小鼠模型的方法,包括以下步骤:确定小鼠Piwil1基因打靶位点序列;制备gRNA;体外显微注射:收集小鼠受精卵,将gRNA和Cas9 RNA注射进入小鼠的受精卵,对注射的受精卵进行移植培育。本发明利用CRISPR‑Cas9系统构建了MIWI D633A基因突变小鼠,雄性杂合子性活动能力正常,有一定数量的精子,可与雌鼠交配,正常形成精栓,但可导致不育,本发明所构建的基因突变小鼠可用于遗传工程小鼠的制备。
  • 一种安全高效的CRISPR/Cas9基因编辑方法-201910536641.1
  • 杨国华;王磊;李季;胡俊 - 武汉百翼生物科技有限公司
  • 2019-06-20 - 2019-09-24 - C12N15/90
  • 本发明涉及基因工程技术领域,尤其是一种安全高效的CRISPR/Cas9基因编辑方法,包括以下步骤:S1、对目标基因上的靶基因序列进行确定,并揭开目标基因的DNA双螺旋,采用Cas9体外酶对其进剪切,目标基因的DNA序列造成断裂,敲除去带病基因片段;S2、设计出sgRNA序列,并进行人工合成;S3、选取感受态的细菌,对其进行解冻;S4、将菌种接种到BL溶液中,保持温度为37℃,转速为250r/min的环境中培养,并进行过夜;S5、挑取单克隆,采用碱裂解法提取质粒;S6、吸取无血清和抗生素的DMEM培养基到无菌的离心管中,加入6μl转染试剂PEI并吹打混合均匀,并加入2μg质粒DNA混合均匀,温度控制为37℃。本发明具有成本低、制作简便、快捷高效的特点。
  • 利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆-201910531285.4
  • 李树峰;佟慧丽;严云勤 - 东北农业大学
  • 2019-06-19 - 2019-09-20 - C12N15/90
  • 利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆,属于基因工程技术领域,其特征在于:细胞克隆被分离纯化且经过2%马血清诱导分化后可以形成肌纤维;该骨骼肌卫星细胞具有融合为肌管的能力;MSTN基因敲除载体靶位点已成功连接,未发生碱基突变;实验组细胞经分化能够形成一定数目的肌管,表明干扰MyoG基因后,细胞依然能够分化成为肌管,但总体肌管融合率降低,形态和数目较对照组有极显著差异。
  • 一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法-201910236645.8
  • 金子兵;刘慧 - 温州医科大学
  • 2019-03-27 - 2019-09-17 - C12N15/90
  • 本发明提供一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法,其步骤包括:(a)通过对人胚胎干细胞中人视网膜母细胞瘤RB1等位基因进行基因编辑,或将携带RB1等位基因突变Rb病人的体细胞重编程为人诱导多能干细胞,建立RB1等位基因突变或敲除的人多能干细胞系,进一步筛选及鉴定;(b)利用体外三维视网膜分化体系诱导RB1等位基因突变或敲除的人多能干细胞分化为人视网膜母细胞瘤模型。本发明利用了与病人遗传背景相同的RB1基因突变或敲除的多能干细胞,在体外视网膜组织发育过程中自发形成人视网膜母细胞瘤,能更加真实地模拟病人肿瘤生长环境和肿瘤发生发展过程,为进一步研究肿瘤发病机制及治疗提供了更加可靠的模型。
  • 一种LRFFT2细胞的构建方法-201910438800.4
  • 焦顺昌;张嵘;张天赋;周子珊;解佳森;吴子明;彭刚 - 北京鼎成肽源生物技术有限公司;焦顺昌
  • 2019-05-24 - 2019-09-06 - C12N15/90
  • 本发明提供一种LRFFT2细胞的构建方法,使用人源外周血进行ctDNA测序或肿瘤组织进行全外显子测序,筛选出突变位点进行抗原表位预测,连接并合成突变多肽表达基因序列;同时构建慢病毒载体,包装慢病毒,转染APC细胞,完成特异性LV细胞的改造,体外与从外周血中分离的PBMC共培养,筛选出有效多肽,通过精准有效多肽刺激的第二次冲击,将普通T细胞改造成为具有更精准杀伤能力的RFF细胞;再利用TCR-T技术原理进行了改造;改造后的T细胞在体外用抗体药物进行免疫抑制性信号的封闭,精准的保护了特异性杀伤T细胞免受体内抑制,提高了T细胞对肿瘤细胞的杀伤力,得到更为攻防兼备的LRFFT2细胞。LRFFT2细胞可广泛应用于个体化精准治疗实体肿瘤。
  • 一种小片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼-201910275901.4
  • 陈湘定;万思瑶;王焱;邓云;邓红文;谭丽君;廖美 - 湖南师范大学
  • 2019-04-08 - 2019-08-27 - C12N15/90
  • 一种小片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼,该斑马鱼获得方法包括如下步骤:CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计构建表达载体以及体外合成;斑马鱼胚胎的显微注射;T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性;注射两个月之后,进行剪尾鉴定;目的序列的TA克隆;质粒的Sanger测序;获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代;获得斑马鱼突变体的F2代纯合子;依据步骤九方法进行stat1a基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传,得到stat1a‑17的斑马鱼纯合品系;筛选stat1b基因突变缺失型斑马鱼;筛选stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼。
  • 一种RFF1细胞的构建方法-201910438799.5
  • 焦顺昌;张嵘;周子珊;解佳森;王海燕;李营营 - 北京鼎成肽源生物技术有限公司
  • 2019-05-24 - 2019-08-16 - C12N15/90
  • 本发明公开提供了一种RFF1细胞的构建方法,属于生物技术领域。该方法用于构建一种用于细胞免疫治疗的RFF1细胞,是一种攻防兼顾的超级T细胞,精准性高、杀伤率高。该构建方法包括以下步骤:PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽,而后对负载多肽后的PBMC细胞进行多肽冲击;冲击后扩大培养,得到FF细胞;以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激该FF细胞以筛选精准多肽;基于CRISPR技术敲除PBMC细胞上的免疫抑制性信号分子;以所述精准多肽负载PBMC并与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC细胞混合后共培,在共培过程中,用精准多肽进行多次冲击,得到RFF1细胞。该构建方法可用于细胞免疫治疗技术。
  • 一种基于PspCas13b-Alkbh5单基因特异性m6A修饰编辑方法-201910297682.X
  • 王红胜;黎婕昕 - 中山大学
  • 2019-04-15 - 2019-07-26 - C12N15/90
  • 本发明公开了运用PspCas13b结合m6A去甲基化酶Alkbh5靶向mRNA去甲基化修饰的应用。本发明研究表明PspCas13b‑Alkbh5融合蛋白可通过特异性gRNA靶向目的基因(如CYB5A、CTNNB1等)mRNA进行去甲基化修饰,进而调控目的基因表达。m6A RNA免疫沉淀实验及m6A位点定量PCR结果表明PspCas13b‑Alkbh5融合蛋白可有效降低细胞内目的基因mRNA的m6A甲基化水平,同时暂未发现脱靶现象。本发明以PspCas13b为手段,结合m6A去甲基化酶Alkbh5首次实现了靶向mRNA的去甲基化修饰,并以此为基础调控特定目的及应用的表达,突破了以往基于改变DNA遗传信息而实现的特定蛋白表达调控,为日后各种疾病的治疗提供了一个新的具有重要潜力的治疗方式及治疗策略,具备良好的应用前景。
  • 与恶性胸腔积液相关的靶点MYO9B及其应用-201910462541.9
  • 施焕中;伊凤双;翟侃 - 首都医科大学附属北京朝阳医院
  • 2019-05-30 - 2019-07-26 - C12N15/90
  • 本发明公开了与恶性胸腔积液相关的靶点MYO9B及其应用。本发明还公开了如下1)‑5)中任一种应用:1)抑制MYO9B蛋白活性的物质在制备治疗或辅助治疗恶性胸腔积液的产品中的应用;2)抑制MYO9B蛋白活性的物质在制备降低或减少恶性胸腔积液患者胸腔积液量的产品中的应用;3)抑制或沉默MYO9B基因表达的物质在制备治疗或辅助治疗恶性胸腔积液的产品中的应用;4)抑制或沉默MYO9B基因表达的物质在制备降低或减少恶性胸腔积液患者胸腔积液量的产品中的应用;5)MYO9B蛋白及其相关信号通路作为靶点在开发或设计治疗或辅助治疗恶性胸腔积液的产品中的应用。
  • 一种大片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼-201910275902.9
  • 陈湘定;王焱;万思瑶;邓云;邓红文;谭丽君;廖美 - 湖南师范大学
  • 2019-04-08 - 2019-07-12 - C12N15/90
  • 一种大片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼,其获得方法包括如下步骤,CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计;构建表达载体以及体外合成;斑马鱼胚胎的显微注射;T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性;注射两个月之后,进行剪尾鉴定;目的序列的TA克隆;质粒的Sanger测序;获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代;获得斑马鱼突变体的F2代纯合子;依据步骤九方法进行stat1a基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传,得到stat1a‑17的斑马鱼纯合品系;筛选stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼。
  • 一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法及其发酵制备维生素K2的方法-201910181289.4
  • 郑之明;王晗;王鹏;王丽;赵根海;刘会;方志伟;唐恒芳 - 中国科学院合肥物质科学研究院
  • 2019-03-11 - 2019-07-05 - C12N15/90
  • 一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法及其发酵制备维生素K2的方法,包括下列步骤:步骤1:以pKD46质粒为模板,以Up‑AmpR‑F和AmpR‑Down‑R为引物,通过PCR获得包含有同源臂的重组片段;步骤2:构建纳豆芽孢杆菌的感受态细胞,将步骤1获得的包含有同源臂的重组片段转导进入所述纳豆芽孢杆菌的感受态细胞内,诱导同源重组;步骤3:以氨苄青霉素作为筛选压力,挑选阳性克隆;步骤4:以Verify‑F和Verify‑R为引物,通过PCR确定所述阳性克隆的真实性;步骤5:以氨苄青霉素为培养压力,对阳性克隆进行驯化培养获得纳豆芽孢杆菌工程菌。本发明以清夜进行发酵,具有生产效率高的优点。
  • 一种基因编辑系统及其在新金色分枝杆菌中的应用-201910225056.X
  • 饶志明;童丽珍;江文慧;李施琼;刘秋林;刘栗彤;林春;邵明龙 - 江南大学
  • 2019-03-25 - 2019-07-05 - C12N15/90
  • 本发明公开了一种基因编辑系统及其在新金色分枝杆菌中的应用,属于基因工程技术领域以及生物工程技术领域。此系统可达到对新金色分枝杆菌进行基因编辑的目的,其工作机制如下:先将pML‑Cpf1质粒导入新金色分枝杆菌中,使得pML‑Cpf1质粒上的Cpf1基因、编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因表达,然后将pJM‑crRNA质粒导入新金色分枝杆菌中,使得pJM‑crRNA质粒转录生成crRNA序列,crRNA序列会与Cpf1基因结合形成复合物,此复合物会靶向并切割需编辑基因使得新金色分枝杆菌中需编辑的基因被敲除。
  • 一种对地贫患者的造血干细胞进行基因修正的方法-201910308856.8
  • 陈相波;应荣;田朋飞;雷鸣 - 杭州荣泽基因科技有限公司
  • 2019-04-17 - 2019-07-05 - C12N15/90
  • 本发明公开了一种对地贫患者的造血干细胞进行基因修正的方法,其特征在于,包括如下步骤:步骤一,在HBB基因‑28(A/G)位点附近选择CRISPR靶点,设计gRNA序列;步骤二,构建一个模版质粒,在HBB基因CRISPR靶点上下游两段500bp序列之间插入piggyBac的双ITRs序列;步骤三,用转染试剂、模版质粒、gRNA和Cas9载体共同转染地贫患者造血干细胞,再对细胞培养基进行嘌呤霉素筛选;步骤四,对抗性基因进行鉴定和验证;本发明将CRISPR/Cas9系统和piggyBac联合使用,可以有效地转染地贫患者的造血干细胞,提高同源重组的效率,有效地对地贫患者的‑28(A/G)突变位点进行修正。
  • 一种基因敲除选育mir196a基因缺失型斑马鱼的方法-201910158021.9
  • 谢华平;曾婷;谢缤灵;付贵芳;袁春燕;陈湘定;印遇龙 - 湖南师范大学
  • 2019-03-02 - 2019-06-18 - C12N15/90
  • 本发明涉及基因敲除技术领域,特别是公开了一种基因敲除选育mir196a基因缺失型斑马鱼的方法,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,在斑马鱼的mir196a基因上设计合适的打靶位点,在体外合成的特异性sgRNA和Cas9‑mRNA,显微共注射进入斑马鱼一细胞内,胚胎培养36小时后,通过选取胚胎进行基因型分析,从而证实了所选位点的有效性。本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中敲除特定基因,且制作简单、成本低,且可同时对靶基因上多个位点进行剪切,沉默任意数目的单个基因。且干扰掉mir196a基因,并且通过遗传学手段研究其功能,有助于进一步揭示肠道形态发生的整个过程以及调控这些过程的分子机制,在医学上肠道疾病病理的理解和新的治疗方案的研发中具有十分重要的意义。
  • 一种构建桔小实蝇白眼品系的方法-201810675973.3
  • 颜日辉;赵三涛;刘焱晖;刘中更;刘向蕊;郉增珠 - 海南大学
  • 2018-06-27 - 2019-06-11 - C12N15/90
  • 本发明公开了一种构建桔小实蝇白眼品系的方法,将Cas9 mRNA与靶基因gRNA混合后,利用显微注射的方式,注射到胚胎中,再经过遗传杂交获得桔小实蝇白眼品系。本发明考虑了最佳的研究步骤和技术参数,构建了桔小实蝇白眼品系的基因编辑方法,快速、准确地获得稳定遗传的纯合桔小实蝇白眼品系,填补了技术空白,为桔小实蝇的生物学研究提供了理想的实验材料及研究思路,具有良好的应用前景。
  • CRISPR-Cas9系统介导的小鼠FGF5基因敲除的方法-201711145330.X
  • 郭旭东;白宇;张晓枫;张蒙;梁浩 - 内蒙古大学
  • 2017-11-19 - 2019-05-28 - C12N15/90
  • 本发明是根据小鼠FGF5基因序列,构建基于CRISPR‑Cas9系统的sgRNA表达载体,将sgRNA和Cas9 质粒混合物对受精卵原核注射,胚胎移植,品系基因鉴定,得到基因突变鼠,并pcr测序,确认最终得到遗传性小鼠突变模型。本发明构建的CRISPR‑Cas9介导的打靶载体为小鼠FGF5基因的敲除提供了一种简便快速安全的途径,该方法实现了不添加任何筛选标记即可筛选定点整合外源基因细胞系,大大提高了转基因动物的安全性,对小鼠的遗传育种具有重要价值。
专利分类
×

专利文献下载

说明:

1、专利原文基于中国国家知识产权局专利说明书;

2、支持发明专利 、实用新型专利、外观设计专利(升级中);

3、专利数据每周两次同步更新,支持Adobe PDF格式;

4、内容包括专利技术的结构示意图流程工艺图技术构造图

5、已全新升级为极速版,下载速度显著提升!欢迎使用!

请您登陆后,进行下载,点击【登陆】 【注册】

关于我们 寻求报道 投稿须知 广告合作 版权声明 网站地图 友情链接 企业标识 联系我们

钻瓜专利网在线咨询

400-8765-105周一至周五 9:00-18:00

咨询在线客服咨询在线客服
tel code back_top