[发明专利]莲草直胸跳甲热激蛋白基因的系统筛选及克隆鉴定方法

摘要

本发明涉及一种莲草直胸跳甲热激蛋白基因的系统筛选及克隆鉴定方法，属于基因工程技术领域，包括取1~3龄幼虫，蛹为2~6日龄，成虫为1日内刚羽化，将以上处理样品收集在液氮中冻存；合成mRNA的全长cDNA并筛选全长cDNA片段，构建不同大小的cDNA文库；再次PCR扩增放大筛选的全长cDNA；对全长cDNA进行末端修复；然后再进行二次筛选，获得测序文库；文库构建完成后，对文库大小进行检测，文库质量检测结果达到要求后进行上机测序，再将得到的非冗余转录本序列与NR、Swissprot、GO、COG、KOG、Pfam、KEGG数据库比对，获得转录本的注释信息并筛选出所有热激蛋白基因，然后对每一条热激蛋白的EST序列群进行拼接组装，进而获得最完整的基因序列，最后根据完整序列设计引物、克隆测序。

主权项

1.莲草直胸跳甲热激蛋白基因的系统筛选及克隆鉴定方法，其特征在于：按照以下步骤进行，a、莲草直胸跳甲各虫态的样品处理与制备所取材料为25℃标准饲养的莲草直胸跳甲各虫态，具体为：卵为24h内所产，1～3龄幼虫进行24h饥饿处理，蛹为2～6日龄，成虫为1日内刚羽化；将以上处理样品收集在液氮中冻存，用于后续试验，各虫态RNA样品的制备均使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen，Valencia,CA,USA)，然后1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA是否降解和有污染，NanoDrop ND‑1000 spectrophotometer(NanoDrop Technologies,Rockland，DE，USA)测定RNA样品的浓度及纯度，Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies，CA,USA)再次精确检测RNA样品的完整性，最后将各虫态的总RNA混合用于文库构建及上机测序；b、文库构建和SMRT测序使用SMARTer^TMPCR cDNA Synthesis Kit合成mRNA的全长cDNA；使用BluePippin筛选全长cDNA片段，构建不同大小的cDNA文库；再次PCR扩增放大筛选的全长cDNA；对全长cDNA进行末端修复；连接SMRT哑铃型接头；进行核酸外切酶消化；使用BluePippin进行二次筛选，获得测序文库；文库构建完成后，使用Qubit2.0进行准确定量，使用Agilent 2100对文库大小进行检测，文库质量检测结果达到要求后进行上机测序，使用PacBio RS II进行全长转录组测序；c、热激蛋白基因的筛选及克隆鉴定使用BLAST软件version 2.2.26将得到的非冗余转录本序列与NR、Swissprot、GO、COG、KOG、Pfam、KEGG数据库比对，获得转录本的注释信息并筛选出所有热激蛋白基因，然后对每一条热激蛋白的EST序列群使用Vector NTI软件进行拼接组装，进而获得最完整的基因序列，最后根据完整序列利用Primer3设计引物、克隆测序。