[发明专利]一种耐热性增强的葡萄糖异构酶及应用

说明书

本发明涉及酶催化技术领域，尤其是一种耐热性增强的葡萄糖异构酶及应用，该葡萄糖异构酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。使用时，取D‑葡萄糖母液，加入PB、纯水，加入葡萄糖异构酶的粗酶液，80℃反应。本发明的耐热性增强的葡萄糖异构酶能够高温催化D‑葡萄糖生成D‑果糖；与野生型葡萄糖异构酶相比，可应用于高温转化D‑葡萄糖生成D‑果糖，表现出更强的热稳定性。

技术领域

本发明涉及酶催化技术领域，具体领域为一种耐热性增强的葡萄糖异构酶。

背景技术

葡萄糖异构酶，也称为D-木糖异构酶，是一种具有极大工业应用价值的酶，在许多微生物中木糖代谢的第一步催化D-木糖异构化为木酮糖。葡萄糖异构酶参与糖代谢，并广泛用于果葡糖浆(HFCS)和生物乙醇的工业生产。这种异构化反应在工业过程中很重要，例如食品工业中果葡糖浆的生产。果葡糖浆本身作为一种甜味剂在美国和日本很受欢迎，是制药、食品和饮料行业中蔗糖或转化糖的替代来源。在果葡糖浆市场需求不断增长的推动下，自1970年代以来，葡萄糖异构酶越来越多地用于从玉米淀粉水解物中生产果葡糖浆，并与淀粉酶和蛋白酶并列成为三种耗用量最大的工业酶。由于含有55％或更多果糖的果葡糖浆比蔗糖具有更高的甜味力，食品和饮料行业对此类糖浆有较大需求，并且随着果葡糖浆市场的增长，对更高效的葡萄糖异构酶的需求也在增长。

在现有的果葡糖浆生产工艺中，来自中温微生物的不耐热葡萄糖异构酶被用于固定化酶反应器中，在50℃和58℃的操作温度下生产40％至42％的果葡糖浆，停留时间小于1小时。如果高于此温度，由于还原糖和蛋白质之间的非酶促反应(例如美拉德反应)，会形成不需要的褐变产物。然而，这种温度限制不利于高葡萄糖转化率。事实上，葡萄糖的异构化会达到一种反应平衡，该平衡在较高温度下向果糖转移。在这个过程中，需要额外昂贵的色谱步骤来获得所需的55％的果糖浆浓度。果葡糖浆-55是食品和软饮料用途所需的更理想的果葡糖浆品种。在果葡糖浆生产过程中，D-葡萄糖到D-果糖的最终转化率与温度高度依赖，往往温度越高更有利于D-果糖的产率。为了避免下游复杂的浓缩步骤，通过促进异构化反应平衡偏向D-果糖形成，直接获得果葡糖浆-55需要更高温度。理论上，由于异构化反应平衡，需要在高温(约95℃)和较低pH(约4.5–5.5)下进行异构化，才能在糖浆中达到所需的果糖水平。如果能够实现这一点，则不需要额外的浓缩步骤。

简言之，与目前使用的酶相比，工业上有价值的葡萄糖异构酶必须具有较低的pH值、较高的温度、对Ca²⁺抑制的抗性以及对葡萄糖有较高的亲和力。因此，目前有大量的研究工作致力于鉴定对葡萄糖具有更高亲和力的热稳定和酸稳定的葡萄糖异构酶。此外，重组DNA技术和蛋白质工程的进步为开发经济可行的商业工艺开辟了新的可能性。出于这个原因，研究人员试图分离出能够在高温下产生高活性和稳定性葡萄糖异构酶的微生物。

美国专利WO2004/044129认为需要发掘在高温度和低pH下保持高水平活性的葡萄糖异构酶。然而，该文件中公开的肽仅在pH 5以上具有最佳活性并且在90℃以上不稳定。更重要的是，为了保持高水平的活性，这些酶需要钴(Co²⁺)作为辅因子。而Co²⁺并不适用于生产供人类食用的果葡糖浆。它不仅与许多可能的健康问题相关,而且废弃介质的处理也可能导致环境污染。最适用的离子为在食品相关应用常用的包括Mn²⁺和Mg²⁺等。然而，这些离子通常仅在与来自非嗜热生物或仅微嗜热生物的酶结合时才有效。

因此，适用于食品工业的最佳葡萄糖糖异构酶应该符合以下条件：它在酸性条件下(即pH值约为6或更低)仍可高效地发挥作用，以避免褐变反应；它可以耐受较高的底物与产物抑制(例如大于200g/L葡萄糖)，以便提高单位体积的生产效率；它应在高反应温度(即80℃或更高)下保持稳定，以促进果糖高转化率；它具有较高的催化活性，可在较短时间内达到反应平衡点，减少能耗及人力消耗；它可不使用有害的金属离子，例如Co²⁺；它可以在常用微生物如大肠杆菌或芽孢杆菌中高效大量地进行重组制备，以便于生产和降低成本。