本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及耐高温的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶及其应用，该耐高温的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示。本发明中的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶TsDAE2，其最适温度为85℃，在80℃条件下的半衰期大于11h，其热催化性能明显优于目前已报导的同类酶。该D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶TsDAE2的最适pH为5.5，在酸性条件下和嗜热葡萄糖异构酶偶联催化500g/L葡萄糖异构化制备D‑阿洛酮糖，反应达到平衡时，D‑阿洛酮糖的终浓度为115g/L，反应液色度为0RBU，基本没有发生美拉德反应。由于本发明采用一步法生产D‑阿洛酮糖，能大幅降低能耗和分离纯化成本，在D‑阿洛酮糖生产等食品加工领域具有应用潜力。
本发明公开了一种β‑葡萄糖苷酶突变体、工程菌及其在降解纤维素中的应用，所述β‑葡萄糖苷酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第20位或第240位进行定点突变获得的。本发明突变酶的比活力比野生酶显著提高1.5倍及以上。以内切葡聚糖苷酶、外切葡聚糖苷酶、裂解多糖单加氧酶与突变酶的混合液为催化剂时，葡萄糖产率较野生酶提高了15％‑25％。
本发明公开了一种磷酸酶突变体及在催化麦芽糊精制备甘露糖中的应用，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第175位、179位或195位进行单点突变获得的。本发明以含磷酸酶突变体编码基因的工程菌发酵培养获得的湿菌体经超声破碎提取的酶液为催化剂，以麦芽糊精为底物，联合葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、甘露糖6‑磷酸异构酶，添加MgCl2和磷酸盐，以pH为7.5～8.5的缓冲液为反应介质构成反应体系，制备甘露糖。本发明磷酸酶突变体F179M通过体外一锅法以麦芽糊精为底物生产甘露糖，转化率达到60‑70％，产物甘露糖与副产物果糖、葡萄糖比例为11:1:1。
本发明公开了一种磷酸酶突变体及在体外多酶催化麦芽糊精制备果糖中的应用，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第173位、175位或179位进行单点突变获得的。本发明以含磷酸酶突变体编码基因的工程菌发酵培养获得的湿菌体经超声破碎提取的酶液为催化剂，以麦芽糊精为底物，联合葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶，添加MgCl2和磷酸盐，以pH为7.5～8.5的缓冲液为反应介质构成反应体系，制备果糖，转化率达到70％以上，产物中果糖与副产物葡萄糖比例为11:1。底物专一性调控后的磷酸酶突变体在体外多酶合成系统生产果糖的绿色合成中具有重要工业应用潜力。
本发明公开了一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第335位或第271位进行突变获得。本发明筛选得到一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体，增强了70℃下的酶半衰期，提高了酶对合成乳果糖所用底物乳糖的底物亲和力和转化效率。运用含有改造酶的基因工程菌进行生物转化，产物乳果糖得率显著增加。本发明展示了纤维二糖差向异构酶在合成乳果糖绿色环保、毒性低，副产物少和产物得率高的技术优势，经过分子改造获得的纤维二糖差向异构酶突变体扩展了相对稀少的乳果糖异构酶酶库，展示了重要的工业应用前景。
本发明公开了一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体、工程菌及其应用，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第226位或第242位进行突变获得。本发明筛选得到一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体，增强了突变酶在70℃下的半衰期，提高了酶对合成乳果糖所用底物乳糖的底物亲和力和转化效率。运用含有改造酶的基因工程菌进行生物转化，产物乳果糖得率显著增加，副产物依匹乳糖得率明显降低。本发明展示了纤维二糖差向异构酶在合成乳果糖绿色环保、毒性低，副产物少和产物得率高的技术优势，经过分子改造获得的纤维二糖差向异构酶突变体具有重要的工业应用前景。
本发明公开了一种α‑转氨酶突变体及其在合成L‑草铵膦中的应用，所述α‑转氨酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第131位或214位进行单突变或多突变获得的。本发明α‑转氨酶突变体可催化20mM底物2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸转化为L‑草铵膦，转化率达96.37％，相比较于野生型，CkTA‑W131Y突变体对PPO的特异性活性提高了1.5倍，CkTA‑A214V突变体对PPO的特异性活性提高了2.8倍，双突变CkTA‑W131Y‑A214V对PPO的特异性活性提高了3.7倍，其最适反应温度为35℃，最适pH为8.5，产物ee值大于99.9％。
