[发明专利]一种提高重组蛋白疫苗安全性的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种提高重组蛋白疫苗安全性的方法及其应用，包括：向表达所述重组蛋白的细菌发酵产物破碎后的上清液中加入pH为7.2～7.4，浓度为35％～50％的饱和硫酸铵溶液，回收蛋白质沉淀。本发明在重组蛋白的制备这一过程中，对于发酵得到的重组蛋白溶液先利用饱和硫酸铵溶液的盐析作用将重组蛋白沉淀出来，在不破坏重组蛋白的免疫原性的情况下实现对重组蛋白溶液中内毒素的去除。经过本发明提供的方法处理过的重组蛋白内毒素含量较低，小于10²EU/ml，且免疫原性几乎不受影响，由该重组蛋白制备而成的疫苗安全性得到了较大的提升。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种提高重组蛋白疫苗安全性的方法及其应用。

背景技术

细菌内毒素(Endotoxin)是革兰氏阴性菌细胞壁中具有稳定生物活性的脂质-糖复合物，其中主要成分是脂多糖(LPS)，其主要毒性成分为类脂质A。内毒素的成分决定了其耐热稳定性，只有在160℃的温度下加热2-4小时，或用强酸、强碱或强氧化剂加温煮沸30分钟才能破坏它的生物活性。内毒素主要位于细胞壁的最外层，覆盖于细胞壁的黏肽上，各种细菌的内毒素的毒性作用大致相同，主要引起发热、内毒素休克、微循环障碍及播散性血管内凝血。当细菌衰亡后释放出大量内毒素，比存在于细胞壁上的内毒素的活性明显增强，具有广泛的生物活性，能引起强烈的内毒素毒性反应。

内毒素广泛存在于化学试剂、生物试剂及药物等产物中，尤其是经革兰氏阴性菌进行发酵的疫苗产品，在发后期菌体衰亡，有大量的内毒素释放到发酵液中。即使可以经过纯化工艺进一步降低内毒素的含量，但所含的内毒素仍然非常高，并且有很多发酵产品不能进行纯化，其内毒素含量如何降低成为了困扰很多人的重要问题。一旦使用含有内毒素或者被内毒素污染的生物试剂，不仅影响试剂的疗效，还存在导致机体产生发热等不良反应的可能。因此研制一种简单方便的去除不能进行纯化的蛋白溶液中内毒素的方法具有重要的意义。

目前对溶液中细菌内素的去除方法主要包括：(1)解毒作用：解毒机理主要包括酶降解细菌内毒素为无毒性片段、细菌内毒素与蛋白质形成可逆复合物、酸碱水解产生解毒作用，该方法会不同程度的影响蛋白质的活性，同时被解毒的内毒素有毒性逆转的可能性；(2)蔗糖密度梯度离心技术：因内毒素本身有不同存在形式、分子大小、密度、沉降系数及分子量不尽相同给此方法的应用造成了一定的困难；(3)亲和层析技术：该方法具有条件温和，较简单，并且有纯化及浓缩抗原的作用，但也存在试剂贵、操作复杂、配基与胶结合稳定性差等缺点；(4)离子交换层析技术：存在设备昂贵、材料损耗大等的问题。

现有技术也有利用氢氧化铝凝胶对蛋白质的静电吸附作用实现对内毒素的去除。相比而言，氢氧化铝法去除细菌内毒素会有成本相对较高，操作繁琐，非特异性吸附目的蛋白进而影响蛋白回收率的缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高重组蛋白疫苗安全性的方法及其应用，用于解决现有技术中，原核表达重组蛋白制备疫苗的过程中由于细菌裂解后产生大量细菌内毒素造成疫苗安全性较差的问题。

第一方面，本发明提供一种提高重组蛋白疫苗安全性的方法，包括：

向表达所述重组蛋白的细菌发酵产物破碎后的上清液中加入饱和硫酸铵溶液，回收蛋白质沉淀；

所述重组蛋白为传染性法氏囊病病毒的衣壳蛋白VP2；

所述饱和硫酸铵溶液的pH为7.2～7.4，加入至所述上清液中后所述饱和硫酸铵溶液的浓度为35％～50％。

传染性法氏囊病病毒的衣壳蛋白VP2在进行原核表达后，由于在蛋白的表达过程中存在加工修饰和折叠的过程使标签被包裹，很难以亲和层析柱法等传统的方法进行内毒素的去除。本发明提供的提高重组蛋白疫苗安全性的方法主要为去除蛋白溶液中细菌内毒素，该方法为利用饱和硫酸铵溶液控制蛋白质分子上离子基团周围水分子数目，即改变蛋白质在水溶液中的溶解度，实现目的蛋白在一定浓度的盐溶液下析出。