[发明专利]人卵巢癌肿瘤标志物HE4酶联免疫诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物工程及疾病检测诊断试剂方法技术领域，特别是HE4基因合成、载体构建、蛋白表达及纯化，HE4用于ELISA试剂盒及其制法。

背景技术

卵巢癌发病隐匿，预后差，是女性最致命的恶性肿瘤之一。如果能在早期诊断卵巢癌将大大提高治愈率，但是卵巢癌患者发现时往往已经到了晚期。目前诊断卵巢癌和监测其复发最为敏感的指标是检测血清CA125。晚期卵巢癌患者中有80％能检测到CA125的升高，而在早期仅有50～60％，并且CA125在某些良性疾病中也会上升，导致一些不必要的手术，大大限制了它的临床应用。于是，许多学者都致力于寻找更为有效的肿瘤标记物，以便早日确诊卵巢癌。

人附睾分泌蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)最早在人的附睾上皮细胞中发现。1999年，Schummer等发现HE4的mRNA在卵巢癌组织中高表达，而在正常组织中低表达或不表达。2003年，Hellstrom等发现HE4在卵巢癌患者的血清中的含量也比正常人有明显增高。因而，HE4作为一个新的卵巢癌的肿瘤标志物，得到了人们更加深入的研究。Hellstrom等人证实，在特异性为100％的情况下，HE4检测卵巢癌的灵敏度为60％，而经典卵巢癌肿瘤标记物CA125的灵敏度仅为13％，而且HE4检测早期卵巢癌的敏感性也明显优于CA125。为进一步证实和扩展HE4在卵巢癌的早期检测和病程监控方面的应用前景，在美国已有近十项临床研究和临床试验正在进行。

发明内容

本发明的目的是提供一种HE4基因合成方法、蛋白表达，合成简单，产品纯度高，另外还提供人卵巢癌肿瘤标记物HE4的ELISA试剂盒制备方法，为卵巢癌早期诊断、疗效观察及预后判断提供一种简便快捷、经济可靠的检测方法。

本发明所采用的技术方案是：HE4基因合成：根据Genbank中公布的人HE4的基因序列并结合大肠杆菌偏爱密码子设计并合成八条PCR引物，通过重叠PCR方法获得HE4基因。

所述HE4蛋白表达：将合成获得的HE4基因克隆入pGEX-4T1载体中，在大肠杆菌中表达并纯化出重组GST-HE4蛋白。经凝血酶切割并纯化得到HE4蛋白纯品。

所述试剂盒的制法：纯化HE4蛋白免疫新西兰兔，制备并纯化多克隆抗体，用纯化HE4蛋白免疫小鼠，通过细胞融合获得杂交瘤细胞株，以此杂交瘤细胞免疫小鼠，制备腹水，腹水中抗体经纯化后用辣根过氧化物酶标记，以多克隆抗体作为捕获抗体，以酶标记单克隆抗体作为检测抗体，建立检测人HE4双抗体夹心ELISA的试剂盒。

目前国内尚无HE4检测试剂盒生产，本发明所研制的试剂盒可望替代进口同类产品，为国家节省大量外汇，可使我国卵巢癌的诊断检测技术达到世界先进水平。

本试剂盒具有高度稳定性、敏感性及特异性，操作简单、快速，适合于卵巢癌的早期、快速诊断。较国外同类产品相比成本便宜，性价比高。

附图说明

图1是本试剂盒的制备工艺流程图。

图2是经重叠PCR获得的HE4基因DNA片段及重组载体pGEX-4T1-HE4的双酶切鉴定结果图。其中，1：HE4基因的PCR结果；2：Marker DL2000；3：Marker DL2000；4：pGEX-4T1-HE4双酶切结果。

图3是GST-HE4融合蛋白IPTG诱导表达的SDS-PAGE电泳(12％)，酶切后HE4蛋白的纯化结果及免疫印迹鉴定结果图。其中，1：pGEX-4T1空载体诱导结果；2：pGEX-4T1-HE4未诱导对照；3：pGEX-4T1-HE4诱导结果；4：蛋白Marker；5：蛋白Marker；6：GST-HE4融合蛋白酶切去除GST后的纯化结果；7：蛋白Marker；8：酶切并纯化后HE4蛋白的免疫印迹结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1：HE4基因的构建、蛋白表达、纯化及鉴定

1.HE4基因的扩增

根据Genbank中所提供的人HE4mRNA序列(NM_006103)，去除N末端30个信号肽，根据大肠杆菌偏爱密码子，设计合成了8个引物，分别命名为P1～P8，引物由大连宝生物公司合成。

P1～P8核苷酸序列组成：

P1：tggttgtgctactttttgttctttacctaatgataaagaaggttcttgtc