本发明涉及生物技术领域,特别涉及用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒,上游引物具有如SEQ ID No.1、4、7、10、13所示的核苷酸序列;下游引物具有如SEQ ID No.2、5、8、11、14所示的核苷酸序列;荧光探针具有如SEQ ID No.3、6、9、12、15所示的核苷酸序列;经取代、缺失或添加一个或多个碱基且与所述核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列;与所述核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列;该组合及检测方法具备极高的灵敏度和特异性,与其他荧光定量PCR相比,可在半小时内获得结果,可达到临床快速检测,有望实现真正的POCT,若推向临床,具有很好的应用前景。