[发明专利]一种利用单克隆细胞分选快速获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法在审
申请号: | 201710632750.4 | 申请日: | 2017-07-28 |
公开(公告)号: | CN107418974A | 公开(公告)日: | 2017-12-01 |
发明(设计)人: | 卢燎勋;张黎琛;梁银明;黄蓉;晁天柱;郑前前;罗静;谷妍蓉;袁鹏 | 申请(专利权)人: | 新乡医学院 |
主分类号: | C12N15/85 | 分类号: | C12N15/85;C12N15/90 |
代理公司: | 郑州睿信知识产权代理有限公司41119 | 代理人: | 胡云飞 |
地址: | 453003*** | 国省代码: | 河南;41 |
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摘要: | 本发明涉及一种利用单克隆细胞分选快速获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法,属于基因工程和遗传修饰技术领域。本发明将CRISPR/Cas9系统、流式细胞仪单细胞分选和表达载体上的荧光蛋白筛选三者结合起来,可以在短时间内获得阳性单克隆,极大地提高细胞系基因敲除工作效率。与传统细胞系基因敲除方法相比,本发明使用流式细胞仪进行单细胞分选,一方面省去了抗生素筛选的繁琐从而可以在非常短时间内获得大量单细胞,另外一方面可以保证每一个培养孔中都是单细胞,减少假阳性率;本发明在细胞转染以后40‑80小时进行分选,此时间点可以保证细胞在分选以后具有最大存活率,进而提高筛选效率。 | ||
搜索关键词: | 一种 利用 单克隆 细胞 分选 快速 获得 crispr cas9 基因 稳定 细胞株 方法 | ||
【主权项】:
一种利用单克隆细胞分选快速获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法,其特征在于:包括如下步骤:1)确定靶序列:在基因组数据库中找到目标基因DNA序列,然后使用软件CRISPOR获得目标基因的靶位点,选择两个特异性靶位点作为sgRNA靶序列;2)设计引物:根据步骤1)获得的sgRNA靶序列分别设计引物,并在引物序列的5‘端添加BbsI酶切位点,得sgRNA引物;分别合成sgRNA引物;3)获得双链的DNA片段:将步骤2)中合成的sgRNA引物组合后退火、磷酸化获得带有粘性末端的双链DNA片段;4)获得载体DNA片段:使用BbsI酶切pX458质粒,回收线性质粒DNA,获得具有粘性末端的载体DNA片段;5)获得Cas9‑sgRNA表达载体:将步骤3)中得到的带有粘性末端的双链DNA片段分别与步骤4)中得到的具有粘性末端的载体DNA片段混合,加入T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌,培养后挑选大肠杆菌单菌落测序验证,正确的即为Cas9‑sgRNA表达载体;6)将两种Cas9‑sgRNA表达载体等质量混合后,通过脂质体介导的转染方式转染细胞系,转染40‑80小时后进行单克隆分选;7)利用流式细胞仪进行单克隆分选,将荧光蛋白阳性细胞按照1个细胞分选到1个孔的方式分选到加了全培养基的微孔板中;进行分选时加Sytox blue核酸染料去除死细胞;8)培养分选得到的GFP阳性单细胞,增殖后获取细胞基因组DNA;9)设计包含靶位点目的片段的检测引物,以步骤8)得到细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增;鉴定PCR扩增产物,选择CRISPR/Cas9基因敲除细胞株,扩大培养后冻存。
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- 彭大新;查夕馨;陈素娟;秦涛 - 扬州大学
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- 本发明涉及动物疫苗技术领域,尤其涉及转染293T和DF‑1共培养细胞的H9N2亚型冷适应减毒活疫苗的拯救方法。选择一株H9N2亚型冷适应减毒株TX‑25‑CE30,构建表达其基因的8个质粒,以TX‑25‑CE30内部基因为骨架,以其母本毒株TX株HA、NA基因为外部基因,转染人胚肾细胞293T与鸡成纤维细胞系DF‑1共培养细胞,拯救出对哺乳动物细胞感染能力较弱的毒株,命名为rTXca‑HA‑NA,该重组病毒免疫鸡后对同源毒株的一次免疫保护率可达100%。
- 外源基因定点整合至GAPDH基因下游的打靶载体构建方法及其应用-201910559340.0
- 阮进学;韩晓松;赵书红;熊友才;庄荣志;赵长志;余梅;李新云;李长春;谢胜松;付亮亮;赵云霞 - 华中农业大学
- 2019-06-25 - 2019-10-08 - C12N15/85
- 本发明公开了一种将外源基因定点整合至猪GAPDH基因下游的打靶载体,所述打靶载体是以GAPDH基因终止密码子上下游序列作为左、右同源臂,将左同源臂、2A序列、外源基因序列和右同源臂依次连接起来,反向插入到真核表达载体的多克隆位点上。将该打靶载体与含特异性靶向猪GAPDH基因下游的sgRNA的CRISPR/Cas9切割载体共转染猪真核细胞中,可以将外源基因定点整合至GAPDH基因下游。本发明提供的这一打靶位点,可以拓宽外源基因在猪基因组中整合位点的范围,为制备外源基因在猪基因组中高效稳定的表达奠定基础。
- 一种稳定表达VP1融合EGFP的单克隆细胞株的制备方法-201910575181.3
- 高凤山 - 大连大学
- 2019-06-28 - 2019-10-08 - C12N15/85
- 一种稳定表达VP1融合EGFP的单克隆细胞株的制备方法,属于疫苗技术领域。本发明解决技术问题的技术方案包括以下步骤:培养细胞PK15、G418的适用浓度应为500μg/mL、将LipofectamineTM2000与pEGFP‑N1‑VP1质粒以1:1的比例转染至PK15细胞、G418筛选、弱酸洗脱得到SLA‑I类呈递肽。
- 专利分类