[发明专利]用于马铃薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.用于马铃薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

A、针对待测淀粉均呈现为干品的特点，淀粉中含有包括糖类在内的多种次生代谢产物对DNA提取造成干扰，采用具有针对性的特定提取方法从待测淀粉中提取其DNA；

B、荧光定量PCR引物设计：以序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示的人工核苷酸序列为上下游引物；以序列表中SEQ ID NO：3所示的人工核苷酸序列为探针；对待测样品进行检测；

C、根据待测品及所设计引物的特点，设置特定的荧光定量PCR反应体系和操作程序，完成荧光定量PCR；

D、鉴定分析：

D-1、如果所得结果中显示有一条扩增曲线，且同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于2-5；则鉴定被测品被测品为真马铃薯淀粉；

D-2、如果所得结果显示有多条扩增曲线，且其中一条曲线同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于2-5；则鉴定被测品为掺假马铃薯淀粉；

D-3、如果所得结果显示有多条曲线，但是所有曲线均不能同时满足如下两个条件：①曲线的起跳在15-25个循环之前；②扩增浓度数值不低于2-5；则鉴定被测品为不含马铃薯淀粉；

D-4、如果所得结果显示没有扩增曲线，则鉴定被测品为不含马铃薯淀粉。

2.根据权利要求1所述的用于马铃薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：步骤A中，所述从待测淀粉中提取其DNA的特定方法，包括如下步骤：

A-1、称取样品100 mg，放入研钵中，加入定量的液氮进行充分地研磨，制成样品粉末；

A-2、将缓冲液GP1放入水浴锅65 ℃中，进行预热处理，同时加入0.1%浓度体积的巯基乙醇；

A-3、将样品粉末放入经过处理的缓冲液GP1中了，快速地颠倒晃匀，混匀后将离心管迅速地放入水浴锅65 ℃中，并保持20 min，并在这段时间内不断地颠倒晃匀样品；

A-4、把700µL氯仿加入离心管中，颠倒晃匀，并在离心机上以12000转下进行离心，时间为5 min；

A-5、离心好后吸取上清液加入另一个的离心管中，同时把700 µL缓冲液GP2加入，颠倒晃匀；

A-6、将混匀好的缓冲液GP2转入吸附柱GB3，并在离心机上以12000转下离心30 s，去除上清液；

A-7、把500 µL缓冲液GD加入吸附柱GB3，并在离心机上以12000转下离心30 s，去除上清液，同时在收集管中放进吸附柱GB3；

A-8、把600 µL漂洗液PW加入吸附柱GB3，并在离心机上以12000转下离心30 s，去除上清液，同时在收集管中放进吸附柱GB3，多次重复此步骤；

A-9、将装有吸附柱GB3的收集管，放在离心机上以12000转下离心2 min，去除上清液；并将吸附柱GB3在室温下放置几分钟，确保吸附柱中的残留漂洗液PW去除；

A-10、将完全将漂洗液去除干净的吸附柱GB3放入新的离心管中，并将50-200 µL的洗脱缓冲液TE悬空滴加在吸附膜中间部位，并在室温下放置几分钟，之后在离心机上以12000转下离心2 min，收集上清液，即得。

3.根据权利要求1所述的用于马铃薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：步骤C中，荧光定量PCR的反应体系设置为：采用25 μL的扩增体系，其中添加2xSuperReal PreMix Probe 12.5μL、上游引物的浓度为10 μmol/L，用量为0.75 μL、下游引物的浓度为10 μmol/L，用量为0.75 μL、探针的浓度为10 μmol/L，用量为0.5μL、DNA模板为2.0 μL、ddH₂O为8.5 μL；以无菌双蒸水作为空白对照。

4.根据权利要求1所述的用于马铃薯淀粉真伪鉴别及其掺杂分析的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：步骤C中，荧光定量PCR的操作程序设置为：95 ℃预变性时间为15 min；95℃变性时间为3 sec，60℃退火/延伸时间为20 sec，对荧光信号进行采集，共计40个循环。