本发明涉及基因检测技术领域,公开了一种新型冠状病毒宏基因组测序引物、测序方法与应用,测序引物包括针对新型冠状病毒分离毒株基因组全序列设计的60对特异性PCR扩增引物,所述60对特异性PCR扩增引物序列依次为SED ID No.1‑SED ID No.120;测序方法步骤包括:测序样本RNA反转录;测序样本cDNA的特异性扩增,PCR扩增产物利用纯化磁珠试剂进行纯化;利用三代建库试剂盒制备样本文库;将已建库样品进行上机测序本发明能够解决目前新型冠状病毒宏基因组测序准确度较低、宏基因组测序流程时间较长的问题。