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[发明专利]一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用-CN201810990055.X有效
发明人：刘龙;吕雪芹;堵国成;李江华;陈坚 -专利权人：江南大学
申请日： 2018-08-28 - 公布日： 2020-05-29 - 主分类号： C12N1/21 文献下载
摘要：本发明公开了一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，属于遗传工程技术领域。本发明提供了一种以细胞自身功能膜微域FMMs为空间支架，并借助特异性标记蛋白FloA和FloT构建多酶复合体，搭建人工底物通道，有效降低细胞代谢负担，并且多酶复合体挂靠在质膜上，有利于产物由胞内向胞外转运。本发明构建的重组枯草芽孢杆菌在不影响细胞生命活动的前提下，高效合成GlcNAc，并且还可以将有毒中间代谢产物GlcN‑6‑P局限于质膜附近，降低或消除其对细胞活性的抑制。在复合培养基摇瓶发酵过程中，对照菌株BSGC的乙酰氨基葡萄糖的产量仅为0.45g/L，而BSGAT的乙酰氨基葡萄糖产量增加至5.29g/L，是对照菌株的11.76倍。本发明的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。
一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法应用

[发明专利]一种促进枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖合成的方法-CN201810299583.0有效
发明人：刘龙;顾洋;邓洁莹;陈坚;堵国成;李江华 -专利权人：江南大学
申请日： 2018-04-04 - 公布日： 2020-05-08 - 主分类号： C12N1/21 文献下载
摘要：本发明公开了一种促进枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖合成的方法，属于遗传工程领域。本发明是以重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP2作为出发菌株，外源引入来源于蜡样芽孢杆菌的丙酮酸羧化酶BalpycA，消除枯草芽孢杆菌中心碳代谢溢流，避免副产物乙偶姻的合成，进一步引入5个外源还原力代谢反应替换糖酵解途径、三羧酸循环中产生NADH的反应，重构胞内还原力代谢，具体包括甘油醛‑3‑磷酸铁氧还蛋白脱氢酶、异柠檬酸NAD+脱氢酶、苹果酸醌脱氢酶、酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶和固氮酶铁蛋白。在使用复合培养基摇瓶发酵过程中，重组菌株BSGNKAP8乙酰氨基葡萄糖的产量为24.50g/L，乙酰氨基葡萄糖/葡萄糖得率为0.469g/g，分别是出发菌株BSGNKAP2的1.97和2.13倍。
一种促进枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖合成方法

[发明专利]一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用-CN201810347105.2有效
发明人：刘龙;马文龙;陈坚;堵国成;李江华 -专利权人：江南大学
申请日： 2018-04-18 - 公布日： 2020-05-08 - 主分类号： C12N1/21 文献下载
摘要：本发明公开了一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。本发明是以重组枯草芽孢杆菌BSGN11作为出发菌株，通过在关键酶氨基葡萄糖乙酰化酶CeGNA1的N端融合标签，提高其翻译初始速率，从而提高其表达量，促进宿主菌利用丙酮酸的能力，进而将流向丙酮酸的代谢流引流至乙酰氨基葡萄糖合成途径，减弱丙酮酸积累对细胞的抑制作用。本发明得到了一株乙酰氨基葡萄糖积累量提高的枯草芽孢杆菌基因工程菌，摇瓶水平上产量达到9.4g/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。
一种积累乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌及其应用

[发明专利]一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体-CN201711012420.1有效
发明人：刘松;任蕊蕊;李江华;陈坚;堵国成;石诚 -专利权人：江南大学
申请日： 2017-10-26 - 公布日： 2020-05-08 - 主分类号： C12N9/10 文献下载
摘要：本发明公开了一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体，属于基因工程和发酵工程领域。本发明以解脂耶氏酵母为宿主，构建了高产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌po1h/hpro‑mTG。该菌株产酶水平高，摇瓶发酵酶活可达11.7U/mL，较改造前提高了106倍，发酵罐发酵酶活可以达到43.7U/mL。通过共表达蛋白酶TAMEP和hpro‑mTG，实现了谷氨酰胺转氨酶的活性表达，摇瓶发酵酶活可达6.7U/mL，发酵罐发酵酶活达到21.4U/mL。本发明构建的重组菌发酵产酶水平高，可降低谷氨酰胺转氨酶的生产成本，利于谷氨酰胺转氨酶的工业化生产。
一种活性形式表达谷氨酰胺转氨酶突变体

[发明专利]一种体外酶法催化肝素前体制备肝素的方法-CN201710600786.4有效
发明人：康振;陈坚;周正雄;堵国成;李青 -专利权人：江南大学
申请日： 2017-07-21 - 公布日： 2020-05-08 - 主分类号： C12P19/26 文献下载
摘要：本发明公开了一种体外酶法催化肝素前体制备肝素的方法，属生物医药领域。本发明提供了由纯生物酶法合成具有生物学功能的肝素五糖的方法。通过在基因的5’端融合麦芽糖融合蛋白或双亲短肽序列提高相应硫酸转移酶或变构酶的表达量及酶活，由此得到结构稳定、单一的凝血类药物。
一种体外催化肝素体制方法

[发明专利]一种以左旋多巴为底物全细胞转化合成咖啡酸的方法-CN201611158372.2有效
发明人：周景文;陈坚;吕永坤;堵国成 -专利权人：江南大学
申请日： 2016-12-15 - 公布日： 2020-04-21 - 主分类号： C12P7/42 文献下载
摘要：本发明公开了一种以左旋多巴为底物全细胞转化合成咖啡酸的方法，属于生物化工领域。本发明以左旋多巴为底物生物合成咖啡酸。与以往的以L‑酪氨酸为底物的转化方法相比，该方法底物溶解度较高，产量高，转化率，且生产效率高。与化学合成方法相比，该方法的产物为单一的反‑咖啡酸，不需要对同分异构体进行进一步的分离。反应6小时后咖啡酸的产量可达910.90mg/L，转化率为99.70％。
一种左旋多巴底物全细胞转化合成咖啡方法

[发明专利]柠檬酸产量提高的重组霉菌的构建方法及应用-CN201611236665.8有效
发明人：刘龙;殷娴;陈坚;堵国成;李江华 -专利权人：江南大学
申请日： 2016-12-28 - 公布日： 2020-04-21 - 主分类号： C12N1/15 文献下载
摘要：本发明涉及一种柠檬酸产量提高的重组霉菌的构建方法，包括以下步骤：构建HGT1蛋白表达框，HGT1蛋白表达框内包含组成型启动子、与组成型启动子连接的HGT1蛋白编码基因以及与HGT1蛋白编码基因连接的终止子；构建抗性基因表达框，抗性基因表达框内包含组成型启动子、与组成型启动子连接的hph基因以及与hph基因连接的终止子；将HGT1蛋白表达框和抗性基因表达框转化到霉菌中，得到重组霉菌。本发明同时提供一种采用上述方法构建的HGT1蛋白表达框和重组霉菌。本发明同时公开了一种采用上述方法构建的重组霉菌在发酵生产柠檬酸中的应用。本发明通过启动高亲和力葡萄糖转运蛋白表达，进而提高霉菌中柠檬酸的产量，且发酵时间大大缩短。
柠檬酸产量提高重组霉菌构建方法应用

[发明专利]一种转录因子SugR编码基因及其在N-乙酰氨基葡萄糖生产中的应用-CN201911358364.6在审
发明人：卢健行;刘龙;邓琛;刘长峰;卢建功;李江华;堵国成;陈坚 -专利权人：江南大学;山东润德生物科技有限公司
申请日： 2019-12-25 - 公布日： 2020-04-17 - 主分类号： C12N1/21 文献下载
摘要：本发明涉及一种生产N‑乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用，属于代谢工程领域。该重组谷氨酸棒杆菌通过在谷氨酸棒杆菌中过表达自身来源的转录因子SugR得到。本发明的重组谷氨酸棒杆菌提高了乙酰氨基葡萄糖的产量，产量达到26g/L，为进一步代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。
一种转录因子 sugr 编码基因及其乙酰氨基葡萄糖生产中的应用

[发明专利]一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶突变体-CN201711012785.4有效
发明人：刘松;任蕊蕊;李江华;陈坚;堵国成;冯岳 -专利权人：江南大学
申请日： 2017-10-26 - 公布日： 2020-04-17 - 主分类号： C12N9/10 文献下载
摘要：本发明公开了一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶突变体，属于酶工程和发酵工程领域。本发明通过对谷氨酰胺转氨酶成熟区进行定点突变，改变谷氨酰胺转氨酶活性位点附近的氨基酸残基，提高谷氨酰胺转氨酶的催化效率，得到了谷氨酰胺转氨酶酶活的进一步提高的重组菌hpro‑E300W。重组菌hpro‑E300W发酵罐发酵酶活可达59.85U/mL，是目前报道的发酵水平的最高值。此外，本发明通过在谷氨酰胺转氨酶中插入解脂耶氏酵母内源性蛋白酶Kex2识别位点现了谷氨酰胺转氨酶在解脂耶氏酵母中的活性表达。发酵生产杂蛋白少，纯化简单，可降低工业化生产谷氨酰胺转氨酶的成本。
一种活性形式表达谷氨酰胺转氨酶突变体

[发明专利]一种生产麦角硫因的方法-CN201911395493.2在审
发明人：康振;杜养标;王丽;堵国成;陈坚 -专利权人：江苏瑞霆生物科技有限公司
申请日： 2019-12-30 - 公布日： 2020-04-14 - 主分类号： C12N1/19 文献下载
摘要：本发明公开了一种生产麦角硫因的方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种可高产麦角硫因的酿酒酵母工程菌S‑BCDE，将其接种至发酵培养基中发酵60h，即可使发酵液中麦角硫因的产量高达404mg/L。本发明提供了一种可高产麦角硫因的酿酒酵母工程菌S‑PTEF1‑BCDE，将其接种至发酵培养基中发酵60h，即可使发酵液中麦角硫因的产量高达724mg/L。本发明提供了一种可高产麦角硫因的酿酒酵母工程菌S‑PTEF2‑BCDE，将其接种至发酵培养基中发酵60h，即可使发酵液中麦角硫因的产量高达683mg/L。
一种生产麦角方法

[发明专利]一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其应用-CN201911358303.X在审
发明人：卢健行;刘龙;邓琛;刘长峰;卢建功;李江华;堵国成;陈坚 -专利权人：江南大学;山东润德生物科技有限公司
申请日： 2019-12-25 - 公布日： 2020-04-14 - 主分类号： C12N1/21 文献下载
摘要：本发明涉及一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组谷氨酸棒杆菌，该重组谷氨酸棒杆菌通过敲除谷氨酸棒杆菌的L‑乳酸脱氢酶的编码基因ldh得到；重组谷氨酸棒杆菌中还表达有来源于秀丽隐杆线虫的氨基葡萄糖脱乙酰化酶编码基因GNA1。本发明的重组谷氨酸棒杆菌发酵葡萄糖72h的乙酰氨基葡萄糖产量可高达28.6g/L。
一种乙酰氨基葡萄糖产量提高重组谷氨酸杆菌及其应用

[发明专利]一种重组酿酒酵母及其在生产α-红没药醇中的应用-CN201911395507.0在审
发明人：康振;杜养标;王丽;堵国成;陈坚 -专利权人：江苏瑞霆生物科技有限公司
申请日： 2019-12-30 - 公布日： 2020-04-10 - 主分类号： C12N1/19 文献下载
摘要：本发明公开了一种重组酿酒酵母及其在生产α‑红没药醇中的应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种可高产α‑红没药醇的重组酿酒酵母S‑PTEF1‑MrBBS‑PTEF2‑ispA，将此重组酿酒酵母S‑PTEF1‑MrBBS‑PTEF2‑ispA接种至发酵培养基中发酵100h，即可使发酵液中α‑红没药醇的产量高达10.26g/L。本发明提供了一种可高产α‑红没药醇的重组酿酒酵母S‑MrBBS‑ispA，将此重组酿酒酵母S‑MrBBS‑ispA接种至发酵培养基中发酵100h，即可使发酵液中α‑红没药醇的产量高达9.88g/L。
一种重组酿酒酵母及其生产没药中的应用

[发明专利]一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法-CN201710431816.3有效
发明人：张娟;张彦位;陈坚;堵国成;朱凯 -专利权人：江南大学
申请日： 2017-06-09 - 公布日： 2020-04-07 - 主分类号： C12N1/21 文献下载
摘要：本发明公开了一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过在乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000中过量表达来源于乳酸乳球菌L.lactis NZ9000的DLDH蛋白，得到了一株酸胁迫抗性能力显著提高的重组乳酸乳球菌L.lactis NZ9000(pNZ8148‑dldh)。在pH 5.5条件下，重组菌株L.lactis NZ9000(pNZ8148‑dldh)的生物量较对照提高约9.53％；pH 4.0条件下胁迫3.5h，重组菌株的存活率为对照的7.3倍。本发明还提供了一种提高酸胁迫抗性的方法，该方法具有良好的工业应用价值。
一种提高乳酸菌胁迫抗性方法

[发明专利]一种自组装双亲短肽及其应用-CN201710247285.2有效
发明人：刘松;陈坚;堵国成;赵伟欣 -专利权人：江南大学
申请日： 2017-04-14 - 公布日： 2020-03-06 - 主分类号： C07K7/08 文献下载
摘要：本发明公开了一种自组装双亲短肽及其应用，属于基因工程及酶工程技术领域。本发明通过在异源表达的蛋白质N端融合一段亲疏水性氨基酸交替分布并含有组氨酸的自组装双亲短肽(S1v1,AEAEAHAHAEAEAHAH)，可使用亲和层析方法进行蛋白质纯化，并在不同程度上提高酶蛋白的异源表达产量及热稳定性。该方法效果显著、工艺简单、便于推广。为快速纯化酶蛋白及提高酶蛋白表达量提供了新的方法和思路。
一种组装双亲及其应用

[发明专利]一种高产肝素前体的重组枯草芽孢杆菌及其应用-CN201611149201.3有效
发明人：康振;陈坚;堵国成;张琳培;王浩;周正雄 -专利权人：江南大学
申请日： 2016-12-14 - 公布日： 2020-03-06 - 主分类号： C12N1/21 文献下载
摘要：本发明公开了一种高产肝素前体的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明在产肝素前体的枯草芽孢杆菌中，共表达了UDP‑GlcUA途径和UDP‑GlcNAc途径中的关键酶基因，获得了肝素前体产量及分子量均增大的重组菌株。当共表达tuaD，gtaB，glmU，glmM和glmS基因，摇瓶中肝素前体产量提高至2.89g/L，分子量为75.90kDa。通过在3L发酵罐中进行补料分批发酵，肝素前体的产量最终积累到7.25g/L，分子量为46.66kDa。本发明为工业化生产肝素奠定了基础。
一种高产肝素重组枯草芽孢杆菌及其应用