[发明专利]一种DNA点突变定量检测方法

摘要

本发明提供了一种DNA点突变定量检测方法，通过PNA探针两次对野生型模板的抑制，极大程度地抑制了野生型模板的扩增，解决了PNA钳制不完全的问题。同时，利用扩增引物Tm值差异和扩增时退火温度控制，使巢式PCR能在单管中进行，增强了扩增强度和扩增特异性。使拷贝数极低的临床样本的扩增成为了可能。最后，通过实时荧光的闭管检测，既实现了实时检测，又避免了样品的交叉污染，还实现了突变的定量。此外，该方法只需要普通实时荧光PCR仪器，且在2h内就能得到检测结果，试剂成本低，可实现对样品的快速、低成本检测。总之，该方法的成功建立，可为临床DNA点突变的检测提供一种高灵敏、高特异、简便快速、无污染和低成本的检测新方法。

主权项

1.一种DNA点突变定量检测方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)确定待测基因点突变位点，并在所选位点的上游和下游区域分别选择两段序列，

设计2条外引物和2条内引物；外引物扩增产物包含了突变位点，外引物Tm值较高；内引物位于上下游外引物的内部，其Tm值较低；

设计1条PNA探针W‑PNA，为野生型位点特异，即只与野生型DNA完全互补，与突变型DNA有一个碱基的错配；

设计1条LAN探针M‑LNA，为突变型位点特异，即只与突变型完全互补，与野生型DNA有一个碱基的错配；

设计1条内标荧光探针，其与内引物扩增产物非突变位点序列互补，且不与LNA探针存在重叠序列；

(3)将上述的合成的2条外引物和2条内引物、1条PNA探针、1条LAN探针、1条内标荧光探针、高保真Taq酶、高纯水和步骤(1)制备的DNA放入到一个反应体系中；

(4)在上述的反应体系中，以外引物为主进行第一轮PNA钳制反应。扩增时，设置退火温度68℃～72℃，由于外引物Tm值较高，能够与DNA模板互补；对于突变型DNA，W‑PNA与突变型DNA之间存在碱基错配，W‑PNA探针不能和突变型DNA互补，则突变型DNA能正常被外引物扩增。对于野生型DNA，由于W‑PNA探针的抑制延伸作用，无法正常扩增，这样就进行了第一次的PNA钳制反应和突变型DNA的富集；

由于外引物的浓度较低，在10～20个循环的预扩增以后，外引物被消耗完，不会对其后的内引物扩增造成干扰；内引物由于Tm值较低，在高退火温度下不会对外引物扩增造成影响；

(5)在上述的反应体系中，以内引物为主进行第二轮PNA钳制反应，扩增以步骤(4)得到的产物为模板，扩增时，设置退火温度56℃～62℃，这时内引物能和所述模板互补；对于突变型DNA，由于W‑PNA与突变型DNA存在错配，在相应退火温度下不能与突变DNA结合，则突变型DNA能被内引物正常被扩增，对于野生型DNA，由于W‑PNA探针的抑制延伸作用，无法正常扩增，这就第二次抑制了野生型DNA，富集了突变型DNA；

(6)最后，反应体系中的LNA荧光探针与突变型DNA扩增产物结合，并产生荧光，通过荧光信号强弱和标准曲线来监测PCR扩增体系中突变型DNA的含量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述外引物Tm值为68℃～72℃，其扩增产物包含了突变位点。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述内引物位于上下游外引物的内部，其Tm值为56℃～62℃。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述LNA探针5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有TAMA淬灭基团；内标探针5’端标记有HEX荧光基团，3’端标记有BHQ1淬灭基团。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中，第一轮PNA钳制反应，热循环反应设置为先95℃保持30sec；然后95℃，5sec、再68℃34sec，循环15次。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(5)中，第二轮PNA钳制反应，热循环反应设置为先95℃保持5sec；然后降温到60℃,34sec，一共循环40次。