[发明专利]一种重组人粒细胞集落刺激因子的复性及纯化方法在审
| 申请号： | 201810038737.0 | 申请日： | 2018-01-16 |
| 公开（公告）号： | CN110041423A | 公开（公告）日： | 2019-07-23 |
| 发明（设计）人： | 赵俊;孟凯特;张道平;张林;张瑜;王晓慧;李昕;孙中涛;方雅;文勇 | 申请（专利权）人： | 江苏奥赛康药业股份有限公司 |
| 主分类号： | C07K14/535 | 分类号： | C07K14/535;C07K1/14;C07K1/18 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 211112 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 复性 重组人粒细胞集落刺激因子 包涵体 溶解液 复性缓冲液 半胱氨酸 包涵蛋白 层析纯化 蛋白纯度 工艺操作 弱阳离子 设备要求 生产规模 层析柱 复性率 胱氨酸 配基 上样 用时 制备 放大 复合 节约 | ||
【权利要求书】：
1.一种重组人粒细胞集落刺激因子的复性及纯化方法，包括：
1）将重组人粒细胞集落刺激因子包涵体用裂解液溶解，加入DTT，得到包涵体溶解液；
2）将包涵体溶解液加入到复性缓冲液中，加入胱氨酸和半胱氨酸，进行复性，得到重组人粒细胞集落刺激因子复性液；
3）将重组人粒细胞集落刺激因子复性液上样至复合配基的弱阳离子层析柱进行纯化。
2.根据权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的复性及纯化方法，其特征在于步骤2）中所述的复性缓冲液由水、精氨酸、尿素、EDTA-2Na、Tris、pH调节剂组成；或由水、精氨酸、尿素、EDTA-2Na、Tris、山梨醇、pH调节剂组成。
3.根据权利要求2所述的重组人粒细胞集落刺激因子的复性及纯化方法，所述复性缓冲液具备以下一项或多项特征：
精氨酸的含量为5wt%~25wt%；优选精氨酸的含量为8wt%~13wt%或10wt%~15wt%或13wt%~18wt%或15wt%~20wt%或18wt%~23wt%或20wt%~25wt%；或
尿素的浓度为1~3mol/L；优选尿素的浓度为1~2mol/L或1.5~2.5mol/L或2~3mol/L；或
EDTA-2Na的浓度为1~3mmol/L；优选EDTA-2Na的浓度为1~2mmol/L或1.5~2.5mmol/L或2~3mmol/L；或
Tris的浓度为0.05~0.15mol/L；优选Tris的浓度为0.05~0.08mol/L或0.07~0.10mol/L或0.09~0.12mol/L或0.11~0.14mol/L或0.13~0.15mol/L；或
pH为8.0~9.5；或
当含有山梨醇时，山梨醇的含量不高于10wt%；优选山梨醇的含量不高于8wt%；更优选山梨醇的含量不高于5wt%；更进一步优选山梨醇的含量为0.01wt%～5wt%。
4.根据权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的复性及纯化方法，其特征在于步骤2）中所述的加入胱氨酸至终浓度为0.8~2mmol/L，加入半胱氨酸至终浓度为0.1~1mmol/L。
5.根据权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的复性及纯化方法，其特征在于步骤1）具备以下一项或多项特征：
所述的重组人粒细胞集落刺激因子包涵体与裂解液的固液比为1g：（5~10）mL；或
所述DDT的量为加入DTT至终浓度为1~20mmol/L；优选加入DTT至终浓度为5~10mmol/L或9～14mmol/L。
6.根据权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的复性及纯化方法，其特征在于步骤1）所述的裂解液由水、盐酸胍、Tris、pH调节剂组成。
7.根据权利要求6所述的重组人粒细胞集落刺激因子的复性及纯化方法，所述裂解液具备以下一项或多项特征：
盐酸胍的浓度为4～8mol/L；优选盐酸胍的浓度为4～6mol/L或5～7mol/L或6～8mol/L；或
Tris的浓度为0.05~0.15mol/L；优选Tris的浓度为0.05~0.08mol/L或0.07~0.10mol/L或0.09~0.12mol/L或0.11~0.14mol/L或0.13~0.15mol/L；或
pH为7.0~9.5；优选pH值为7.0~8.0或7.5～8.5或8.0～9.0或8.5～9.5。
8.根据权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的复性及纯化方法，其特征在于步骤3）所述的复合配基的弱阳离子填料选自Capto MMC填料、Generic MC-CM填料或Eshmuno HCX填料；优选Capto MMC填料。
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