[发明专利]一种基于高通量测序检测小鼠DNA TCR beta链免疫组库的方法及其专用引物组在审
| 申请号： | 201811609970.6 | 申请日： | 2018-12-27 |
| 公开（公告）号： | CN109517885A | 公开（公告）日： | 2019-03-26 |
| 发明（设计）人： | 姬晓雯;冯越 | 申请（专利权）人： | 北京迈基诺基因科技股份有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6806 | 分类号： | C12Q1/6806;C12N15/11;C12N15/10;C40B50/06 |
| 代理公司： | 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 | 代理人： | 关畅;陈晓庆 |
| 地址： | 101300 北京市顺*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种基于高通量测序检测小鼠DNA TCR beta链免疫组库的方法及其专用引物组。所述引物组由序列表的序列1‑序列24所示的24条引物组成。本发明还保护一种构建小鼠DNA TCRβ链免疫组库的DNA文库的方法，包括如下步骤：(1)以小鼠的基因组DNA为模板，采用所述引物组进行PCR扩增，回收扩增产物；(2)以扩增产物为模板，采用测序平台的正向通用引物和测序平台的反向通用引物进行PCR扩增，回收扩增产物，即为小鼠DNA TCRβ链免疫组库的DNA文库。采用本发明提供的引物组或方法获得TCRβ链免疫组库，具有灵敏度高、特异性高、可重复性高、实验成本低的优势。 | ||
| 搜索关键词： | 免疫组库 小鼠DNA 扩增产物 引物组 高通量测序 测序平台 专用引物 反向通用引物 基因组DNA 回收 可重复性 实验成本 通用引物 灵敏度 检测 构建 小鼠 引物 正向 | ||
【主权项】：
1.引物组，由20条正向引物和4条反向引物组成；所述20条正向引物由正向引物1‑20组成；所述4条反向引物由反向引物1‑4组成；所述正向引物1为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述正向引物2为如下(b1)或(b2)：(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述正向引物3为如下(c1)或(c2)：(c1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述正向引物4为如下(d1)或(d2)：(d1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(d2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述正向引物5为如下(e1)或(e2)：(e1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(e2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述正向引物6为如下(f1)或(f2)：(f1)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(f2)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；所述正向引物7为如下(g1)或(g2)：(g1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；(g2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；所述正向引物8为如下(h1)或(h2)：(h1)序列表的序列8所示的单链DNA分子；(h2)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；所述正向引物9为如下(i1)或(i2)：(i1)序列表的序列9所示的单链DNA分子；(i2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；所述正向引物10为如下(j1)或(j2)：(j1)序列表的序列10所示的单链DNA分子；(j2)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；所述正向引物11为如下(k1)或(k2)：(k1)序列表的序列11所示的单链DNA分子；(k2)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；所述正向引物12为如下(l1)或(l2)：(l1)序列表的序列12所示的单链DNA分子；(l2)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子；所述正向引物13为如下(m1)或(m2)：(m1)序列表的序列13所示的单链DNA分子；(m2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；所述正向引物14为如下(n1)或(n2)：(n1)序列表的序列14所示的单链DNA分子；(n2)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；所述正向引物15为如下(o1)或(o2)：(o1)序列表的序列15所示的单链DNA分子；(o2)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；所述正向引物16为如下(p1)或(p2)：(p1)序列表的序列16所示的单链DNA分子；(p2)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子；所述正向引物17为如下(q1)或(q2)：(q1)序列表的序列17所示的单链DNA分子；(q2)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；所述正向引物18为如下(r1)或(r2)：(r1)序列表的序列18所示的单链DNA分子；(r2)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子；所述正向引物19为如下(s1)或(s2)：(s1)序列表的序列19所示的单链DNA分子；(s2)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19第25‑48位具有相同功能的DNA分子；所述正向引物20为如下(t1)或(t2)：(t1)序列表的序列20所示的单链DNA分子；(t2)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的DNA分子；所述反向引物1为如下(u1)或(u2)：(u1)序列表的序列21所示的单链DNA分子；(u2)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相同功能的DNA分子；所述反向引物2为如下(v1)或(v2)：(v1)序列表的序列22所示的单链DNA分子；(v2)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相同功能的DNA分子；所述反向引物3为如下(w1)或(w2)：(w1)序列表的序列23所示的单链DNA分子；(w2)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具有相同功能的DNA分子；所述反向引物4为如下(x1)或(x2)：(x1)序列表的序列24所示的单链DNA分子；(x2)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相同功能的DNA分子。
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- 本发明涉及一种分子标签的制备方法，包括以下步骤：在DNA分子模板的5′接头端引入barcode序列；用DNA聚合酶延伸3′接头端，与barcode序列互补，得到补齐序列；向补齐序列中加入DNA聚合酶，在补齐序列的3′接头端引入胸腺嘧啶，得到改造的接头；将待测DNA破碎成DNA短片段，用DNA连接酶连接DNA短片段与改造的接头，得到DNA连接产物；聚合酶链式反应扩增DNA连接产物，得到扩增产物；对扩增产物进行测序，然后比对到人类参考基因组，在多个DNA模板副本中选取碱基错误率最低的DNA序列，即为分子标签。该分子标签技术通过改变barcode长度，去除固定序列，减少测序中数据的浪费，提高了反应速率，能有效区分DNA扩增过程中的错误和真实的DNA变异。
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- 赵柏闻;李晓霖;沈广强 - 北京量化健康科技有限公司
- 2017-05-16 - 2019-09-24 - C12Q1/6806
- 本发明涉及基因芯片技术领域，公开了一种高密度、高稳定性的核酸芯片的制备方法，包括(1)将硅基固相基底羟基化，得到羟基化的固相基底；(2)将所述羟基化的固相基底与第一氨基衍生试剂进行偶联，得到氨基化的固相基底；(3)将所述氨基化的固相基底与氯修饰试剂在4℃左右反应，得到偶联活性基团氯的固相基底；(4)将步骤(3)得到的固相基底与第二氨基衍生试剂在室温下反应；(5)将步骤(4)得到的固相基底与氯修饰试剂在4℃左右反应；(6)重复步骤(4)、(5)一次或多次；(7)将氨基修饰的探针与步骤(6)得到的固相基底在65℃左右进行反应获得核酸芯片。本发明还提供了本发明的方法制备的用于核酸芯片的片基和核酸芯片。
- 一种甄别样品间交叉反应的免疫组库高通量测序文库的构建方法-201910468844.1
- 张镇海;何奖图;蓝春红;王敏惠;朱燕;李丽敏 - 南方医科大学南方医院
- 2019-05-31 - 2019-09-20 - C12Q1/6806
- 本发明涉及一种甄别样品间交叉反应的免疫组库高通量测序文库的构建方法，其特征在于：以大于10ng的RNA为起始量，利用RACE的原理使得RNA在进行逆转录成cDNA的时候进行模板转换，在所有cDNA的5`端加入一段已知的序列，再以此带有已知序列的产物作为模板，使用双端Barcode引物进行PCR扩增，最终得到的产物经过纯化并连接上测序接头序列得到最终的测序文库，利用此测序文库可以对于不同受体来源的样品，在PCR扩增时均能实现只使用一对引物进行PCR扩增，实现等效扩增，解决了因多重引物扩增而产生的引物偏好性问题，同时在PCR扩增时使用的上下游引物均设计由4‑12个不同碱基组成的Barcode进行标记，避免了多个样品同时进行文库构建时出现样品间的交叉反应的问题。
- 核酸液相提取及检测方法-201910524277.7
- 钟镐镐 - 北京大学
- 2011-04-27 - 2019-09-20 - C12Q1/6806
- 本发明涉及核酸液相提取及检测方法。本发明公开了一种从生物样品中提取核酸分析物溶液的方法，包括：将生物样品置于加热容器中；任选地，向该生物样品加入溶解介质；对该生物样品进行高压加热；任选地，对该生物样品进行离心；和获取包含所述核酸分析物的液体。本发明也公开了一种检测核酸分析物的方法，该核酸分析物是用上述提取方法获得的。
- 一种快速构建RNA 3’端基因表达文库的方法-201910552575.7
- 耿亮;辛文 - 北京全式金生物技术有限公司
- 2019-06-25 - 2019-09-20 - C12Q1/6806
- 本发明公开一种快速构建RNA 3’端基因表达文库的方法，包括：使用带有第一接头的Oligo(dT)反转录引物对mRNA样本进行反转录，得到带有第一接头的第一链cDNA；以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，获得带有第一接头的双链cDNA；使用带有第二接头的转座酶复合物处理双链cDNA，在片段化的同时插入第二接头，得到带有第一接头和/或第二接头的双链cDNA片段；其中，所述第一接头与第二接头的序列不完全相同。本发明提供的该方法可有效实现针对真核生物mRNA 3’端的转录组文库构建。
- 核酸序列测序接头及其构建测序文库的方法-201910596995.5
- 赵金银;李宏志;刘琦;许立志 - 北京京诺玛特科技有限公司
- 2019-07-04 - 2019-09-20 - C12Q1/6806
- 本发明提供一种核酸序列测序接头及其构建核酸测序文库的方法。本发明的测序接头包括长Y引物和短Y接头，在测序的插入片段二端都连接有所述短Y接头和长Y引物；所述短Y接头具有部分互补的上游引物F和下游引物R，所述长Y引物具有上游引物P5和下游引物P7；和所述短接头是用来对同一个文库内部的不同分子进行标签识别，而所述长Y引物是用来对不同文库进行标签识别。本发明的核酸测序接头和建库方法能够更加准确的识别突变位点信息，大大提高检测体系的阳性预测能力，克服液体活检应用中存在的问题。
- 核酸文库的动力学排除扩增-201780086213.2
- 肖恩·亨特;彼得·麦金纳尼;乔纳森·鲍特尔;克莱尔·贝维斯-莫特 - 伊鲁米那股份有限公司;伊鲁米纳剑桥有限公司
- 2017-12-15 - 2019-09-20 - C12Q1/6806
- 示例方法包括通过使第一溶液流过在流动池上的扩增位点使第一溶液在流动池上反应以及随后使不同的第二溶液流过扩增位点使第二溶液在流动池上反应。第一溶液包含靶核酸和第一试剂混合物，该第一试剂混合物包含核苷三磷酸和复制酶。第一溶液中的靶核酸以一个转运速率转运至扩增位点并且与扩增位点结合。第一试剂混合物扩增与扩增位点结合的靶核酸，以产生源自对应的靶核酸的扩增子的克隆群体。扩增子以超过转运速率的扩增速率产生。第二溶液包含第二试剂混合物，并且缺乏靶核酸。第二溶液用于增加扩增位点处的扩增子的数目。
- 基于杂交、延伸连接反应的核酸捕获文库制备方法-201910318823.1
- 马晓玲;刘冬梅 - 上海三誉华夏基因科技有限公司
- 2019-04-19 - 2019-09-17 - C12Q1/6806
- 本发明公开了基于杂交、延伸连接反应的核酸捕获文库制备方法，属于核酸检测技术领域。本发明通过设计捕获探针引物，然后与基因组DNA进行杂交反应，得到目的DNA片段后进行延伸、连接反应，后对目的DNA片段进行PCR扩增，纯化后即可进行文库测序。本发明的靶向区域捕获建库方法比较灵活，特异性高，捕获效率高，操作简单，耗时较短，并且能够尽量减少因PCR扩增效率差异造成的捕获区域均一性很差的现象。
- 一种液态产品中外源DNA内标物的保护方法及其应用-201611043650.X
- 安然;梁兴国;王鹏飞 - 青岛千卓分子生物科技有限公司
- 2016-11-24 - 2019-09-10 - C12Q1/6806
- 本发明涉及一种液态产品中外源DNA内标物的保护方法，具体如下：将聚阳离子化合物溶液与目的DNA溶液按照氨基磷酸比≥10:1的比例混合，混匀后2‑20℃放置0.5‑12小时，得到稳定的DNA复合物溶液，可直接添加至液态产品中；所述的氨基磷酸比为聚阳离子所携带的氨基摩尔数与DNA携带的磷酸基团摩尔数的比值。该方法中聚阳离子化合物可以提高外源DNA对核酸酶、酸和自由基等条件的耐受性，使其可作为溯源和防伪的内标物在液态产品或商品中长期稳定存在。
- 一种新的基因组甲基化文库的构建方法和应用-201810162430.1
- 戴珩;柴燕群;章扬;黄炳顶;史耀舟;张伟 - 上海鲸舟基因科技有限公司
- 2018-02-27 - 2019-09-03 - C12Q1/6806
- 本发明提供了一种甲基化测序文库的构建方法。具体地，本发明通过重亚硫酸盐处理构建文库，可同时检测经CT转化的原始链和未经CT转化的互补链序列，直接找出甲基化位点；本发明构建的文库保留了一半未经CT转化的碱基，可大大提高文库碱基平衡性，大幅提高测序质量。
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