本发明属于生物技术领域,具体是一种结直肠癌抑癌基因甲基化高通量检测试剂盒及其应用。试剂盒包括序列如SEQ ID NO:1~20所示的甲基化特异性多重PCR扩增引物和序列如SEQ ID NO:21~41所示的标签引物。本发明能够一次性捕获一个或多个基因的目标甲基化检测区域,获得样本一个或多个基因目标区域甲基化突变序列信息,能够准确有效分析目标区域甲基化状态,使得对目标基因区域进行高通量、高灵敏度、高准确度的甲基化检测成为现实,该方法还具有成本低、操作简便快捷等技术特点,仅通过两轮PCR就可以完成样本文库构建。