[发明专利]Taq DNA连接酶和量子点信号放大的DNA电化学传感器检测单核苷酸多态性的方法

摘要

本发明公开了一种Taq DNA连接酶和量子点信号放大的DNA电化学传感器检测单核苷酸多态性的方法。靶序列的两端分别与CdS量子点指示探针和磁珠捕获探针杂交形成“三明治结构”，加入Taq DNA连接酶修补两探针的空隙，退火连接—变性解链的循环，以靶序列为模板引发两探针之间的链式反应，CdS量子点探针与磁珠探针通过共价键连接，方波伏安法测定Cd²⁺溶出信号，溶出信号与靶序列的浓度的对数值成良好的线性关系；当靶序列存在错配时，连接反应不能进行，检测不到电信号，从而达到了检测单核苷酸多态性的目的。本发明简单快速、灵敏度高、选择性好、仪器成本低，在单核苷酸多态性分析中有着重要的实际意义和发展前景。

主权项

1.一种Taq DNA连接酶和量子点信号放大的DNA电化学传感器检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于具体步骤为：（1） CdS量子点的制备：在100 mL分析纯正庚烷和2mL水的混合液中加入7 g双二乙基琥珀酸钠即AOT，室温下搅拌溶解形成油包水微乳液；将所得混合物分成60 mL和40 mL两份，分别加入240μL浓度为 1 mol/L Cd(NO3)2溶液和160μL 1 mol/L Na2S溶液，室温下分别搅拌1 小时后；在氮气保护下将Cd(NO3)2溶液滴加到Na2S溶液中，产生CdS纳米粒子，搅拌反应1小时；在混合物中依次加入170μL浓度为 0.32 mol/L的半胱氨酸溶液和330μL浓度为 0.32 mol/L 2‑巯乙基磺酸钠溶液，在氮气保护下搅拌24小时，真空蒸发溶剂，残余物依次用分析纯吡啶、分析纯正己烷、无水丙酮、无水甲醇清洗并离心分离，将所得离心液40℃真空干燥即为CdS量子点；（2）量子点指示探针即CdS‑RP探针的制备：取2 mg步骤（1）所得CdS量子点加入到1 mL超纯水中超声分散得到CdS量子点饱和溶液，在450 μL pH7.4磷酸缓冲盐溶液即PBS缓冲溶液中加入0.0086g的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐即EDC和0.0052g的N‑羟基琥珀酰亚胺即NHS，再加入50 μL表面修饰羧基的CdS量子点饱和溶液和100 μL 浓度为10 μmol/L 氨基化的DNA溶液即RP溶液，混合震荡反应24小时；取出混合液，于8000 rpm下离心40分钟，小心去除上层液体，将下层沉淀分散于500 μL pH 7.4 PBS缓冲溶液，即制得CdS‑RP探针，在4℃低温下保存备用；（3）磁珠捕获探针即MB‑CP探针的制备：取50 μL磁珠用100 μL 浓度为0.1 mol/L的咪唑缓冲溶液清洗三次，分散于450 μL PBS缓冲溶液，加入100 μL 浓度为10 μmol/L 的氨基化的DNA溶液即CP溶液，0.0115g的EDC和0.0069g 的NHS将混合溶液震荡反应24小时；取出混合液，磁性分离，小心吸取上清液，先用pH7，NaCl浓度为0.3 mol/L，柠檬酸钠浓度为30 mmol/L的缓冲液即2×SSC溶液清洗磁珠三次，后用焦碳酸二乙酯处理的蒸馏水即DEPC水清洗两次，将磁珠分散于500 μL pH7.4的PBS缓冲溶液，4℃低温下保存备用；（4）杂交与Taq DNA 连接酶连接：在七组PCR管中依次加入10 μL 步骤（2）所制备的CdS‑RP探针溶液、10μL步骤（3）所制备的 MB‑CP探针溶液、14.5μL DEPC水和5 μL 10×连接酶缓冲溶液，以及10 μL浓度范围在1 fM～100 nM的DNA‑7a目标溶液混合，干扰实验中加入10 μL DNA‑7e溶液，空白试验中则加入10 μL TE缓冲溶液，在各组混合液中加入0.5 μL Taq DNA连接酶，用移液枪小心吹打混合均匀；将上述混合液于PCR仪内控制温度在45℃杂交、连接5分钟，85℃下解链30秒，反复循环20次；取出溶液，磁性分离，分别用50 μL 0.1 mol/L pH7.0且含体积百分比浓度为0.2% 的tween‑20的PBS缓冲溶液在95℃下清洗和50 μL DEPC水清洗，磁性分离，加入100 μL浓度为1 mol/L的 HNO3溶液消解10分钟；（5）电化学检测：用0.05 µm Al2O3抛光粉末，在麂皮上将玻碳电极打磨抛光，分别用无水乙醇溶液和二次水超声清洗5分钟和3分钟，将三电极与电化学工作站相连接，应用循环伏安法检测铁氰化钾溶液，当两峰相距小于100 mV时，工作电极可正常使用，当超出100 mV时重新打磨抛光，直至达到标准；将上述HNO3消解溶液全部转移至3 mL pH 4.6含有5 mg/L Bi3+的醋酸缓冲溶液中，应用玻碳电极在‑1.1 V电位下搅拌富集400秒，静置30秒，于‑1.1 V ~ ‑0.3 V范围内进行方波伏安法扫描，记录电化学响应；应用时间‑电流曲线方法将电位加至0.3 V，清洗电极表面400秒，使电极表面膜完全溶出。