[发明专利]一种引物组合及其用于检测乳制品中副干酪乳杆菌的应用

说明书

本发明公开了一种引物组合及其用于检测乳制品中副干酪乳杆菌的应用，该引物组合是基于gyrB基因，通过建立副干酪乳杆菌属的系统发育树，分析副干酪乳杆菌菌种特征，设计特异性引物组合；将所设计引物组合应用于实时荧光定量环介导等温扩增(qLAMP)技术，实现对乳制品中副干酪乳杆菌的检测。本发明的引物组合特异性强、灵敏度高，能够快速检测乳制品中副干酪乳杆菌。本发明适用于对乳制品中副干酪乳杆菌进行定性、定量检测。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及检测菌的引物和方法，具体地说是检测乳制品中副干酪乳杆菌的引物及相应的检测方法。

背景技术

副干酪乳杆菌(L.paracasei)，属于厚壁菌门、杆菌纲、乳酸杆菌目、乳酸杆菌科、乳酸菌种，属于革兰氏阳性菌，常用于牛奶和乳制品的起子或辅助起子，是近年来重点研究的一种益生菌、乳酸菌，经过人体胃肠道消化后，副干酪乳杆菌仍能在肠道内存活，并发挥促进人体消化吸收、调节免疫、改善肠道微生态平衡的益生菌作用。

平板计数法是一种传统的菌落计数法，该方法受主观影响大，繁琐复杂，费时费力，误差大，不能净月地区分出“可存活但不可培养”的细菌细胞，也不能在复杂菌株中有效量化单个菌株，尤其当检测发生在具有复杂微生物群落的发酵系统中，很难用平板计数法对微生物进行定量，特别是在物种水平上。

定量环介导等温扩增(qLAMP)是一种灵敏度高、特异性强的微生物定量分析方法，通过在LAMP反应体系中加入SYBR Green I等荧光染料,扩增反应过程中，荧光强度的增加与LAMP系统产生的双链DNA的数量成正比，根据荧光染料强度与双链DNA数量的相关性，实现对双链DNA的定量分析。由于DNA分子的稳定性，在微生物细菌死亡和裂解后，DNA分子并不会自动分解，因此在使用各种核酸扩增技术时，很难判断阳性扩增结果是活菌还是死菌。因此，迫切需要一种能够区分非活菌与活菌的检测方法。

单叠氮丙啶(PMA)是一种DNA分子核酸染料，只能进入细胞膜不完整的死亡细胞，抑制扩增反应，因此PMA结合qLAMP可实现对活菌细胞的特异性定量。然而，PMA联合qLAMP快速准确检测发酵乳中副干酪乳杆菌的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的一个目的，旨在要提供一种引物组合，是基于gyrB基因及副干酪乳杆菌的菌种特征，设计特异性引物组合，达到可应用于定量环介导等温扩增(qLAMP)技术，特异性、灵敏且快速检测乳制品中副干酪乳杆菌的目的；

本发明的另一个目的，是提供上述引物组合用于检测乳制品中副干酪乳杆菌的应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种引物组合，由外引物、内引物和环引物组合而成，它是基于gyrB基因的引物组合，所述外引物、内引物和环引物及其序列分别为：

外引物FOP：5′-GGCTATGTCTACAT-3′、

外引物BOP：5′-GCGATACCCGCA-3′、

内引物FIP：5′-GCAACTGGCCTAGAATGTTACGCCAAGGCAAAATGACG-3′、

内引物BIP：5′-CGTTACAAAGGGCTTCCGGATCCATGGTCGTCT-3′、

环引物FLP：5′-TTCTTCATCGGAATCGA-3′和

环引物BLP：5′-GAAATGGACGCCAAC-3′。

本发明还提供了上述引物组合用于检测乳制品中副干酪乳杆菌的应用。