[发明专利]检测猫疱疹病毒I型核酸的引物探针组、快速检测试剂盒及方法

权利要求书

1.用于检测猫疱疹病毒I型核酸的引物探针组，由上游引物、下游引物以及探针组成，其特征是，

所述上游引物的序列为5’-GCTACAATTATACTCAAGCCAGAATCG-3’；所述下游引物的序列为5’-GACCGTAAAGCACATATTCCAAATTCCC-3’；所述探针的序列为TTCCCGTTTAGGATCACAAAGTCTCATA/i6-FAMdT/C/idSp/A/iBHQ1dT/AAGAAACATAGGG-3’C3Spacer；在探针中，“i6-FAMdT”为6-FAM荧光标记的dT核苷酸，“idSp”指碱基缺失，“iBHQ1dT”为带有BHQ1淬灭基团标记的dT核苷酸，“3’C3Spacer”指3’羟基封闭。

2.猫疱疹病毒I型核酸的快速检测试剂盒，其特征是，含有权利要求1所述的引物探针组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括冻干酶粉，所述冻干酶粉按管等量分装；所述引物探针组含于冻干酶粉内，所述冻干酶粉中还含有DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、ATP再生蛋白、DNA限制性内切酶、辅助蛋白、磷酸肌酸钠、ATP、dNTP、pH8.0的Tris-Ac、海藻糖、以及KAc。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括裂解液和稀释液，所述裂解液含有KAc、KOH、pH8.0的Tris-Ac、以及水；所述稀释液含有MgAc₂、KAc、pH8.0的Tris-Ac、PEG8K、以及水。

5.非诊断目的猫疱疹病毒I型核酸检测方法，其特征是，采用权利要求4所述的试剂盒，所述检测方法包括以下步骤：

第一步、将目标样本加至裂解液中，混匀后放置至少2分钟；

第二步、从第一步所得混合液中取预定体积的液体加至稀释液中并混匀；

第三步、按管取冻干酶粉，从第二步所得混合液中取预定体积的液体加入管中，充分混匀；

第四步、将第三步所得混合液放入核酸荧光检测仪中进行扩增、采集荧光数据、并绘制时间-荧光信号曲线；

第五步、根据第四步所得时间-荧光信号曲线进行判断：如果该曲线呈S形，则检测结果为阳性；反之，则检测结果为阴性。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征是，第一步中，所述裂解液的体积为500μl；每500μl的裂解液由0.1-2M的KAc 100μl、0.1-2M的KOH 120μl、0.1-2M pH8.0的Tris-Ac250μl、以及水30μl组成；放置温度为15℃-35℃，放置时间为2-3分钟。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征是，第二步中，所述预定体积为20μl，所述稀释液的体积为1ml；每80ml的稀释液由0.1-2M的MgAc₂ 1.12ml、0.1-2M的KAc 1.20ml、0.1-2M pH8.0的Tris-Ac 4.00ml、质量浓度1％-50％的PEG8K 12.00ml、以及水61.68ml组成。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征是，第三步中，所述预定体积为20μl；每管冻干酶粉由20μl冻干酶混合液经冻干后获得，每4ml冻干酶混合液以下组分组成：

120-150ng/μl的DNA解旋酶200μl、400-450ng/μl的单链DNA结合蛋白240μl、90-100ng/μl的DNA聚合酶96μl、5-10ng/μl的ATP再生蛋白80μl、15-20ng/μl的DNA限制性内切酶200μl、15-20ng/μl的辅助蛋白60μl、100μM的上游引物6μl、100μM的下游引物6μl、10μM的探针10μl、1M的磷酸肌酸钠115μl、80-100mM的ATP 115μl、25mM的dNTP 20μl、1-2M pH8.0的Tris-Ac 40μl、质量浓度2-5％的海藻糖8μl、KAc 0.02g、余量为水。