[发明专利]基于BMP3基因甲基化制备结直肠癌早期检测的产品

权利要求书

1.检测BMP3基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，其特征在于，

BMP3基因甲基化序列如下：

GTTAGTTTGGT^mCGGGTGTTTTTAAAAATAAAG^mCGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATT^mCGGGTTATATA^mCGT^mCG^mCGATTTATAGTTTTTTTTTAG^mCGTTGGAGTGGAGA^mCGG^mCGTT^mCGTAG^mCGTTTTG^mCG^mCGGGTGAGGTT^mCG^mCGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTG^mCGTTGGGTTAG^mCGTAGTAAGTGGGGTTGGT^mCGTTATTT^mCGTTGTATT^mCGGT^mCG^mCGTTT^mCGGGTTT^mCGTG^mCGTTTT^mCGTTTTAG；

^mCG表示CpG岛的C发生了甲基化修饰；

使用产品的检测方法包括如下步骤：

步骤一，从生物样本中提取基因组DNA；

步骤二，设计BMP3基因甲基化序列的引物，探针，阳性质控和阴性质控，内部质控；

内部质控，用B2M基因作为内参基因，碱基序列为NCBI数据库中基因序列编号为NG_012920.1第3886到4010位，对应的序列CG以外序列中C转换成T；针对这段转换的序列设计内部质控引物和内部质控探针，并对内控的上下游引物进行筛选，使非模版体系没有明显的扩增曲线，若样本有明显的扩增曲线，则判断为正常；

BMP3引物包括：BMP3正向引物，BMP3反向引物；

BMP3正向引物包括：

SEQ ID NO.1：AAATAAAGCGAGGAGGGAAGG；

SEQ ID NO.2：GAGACGGCGTTCGTAGCG；

SEQ ID NO.3：AGCGTTGGAGTGGAGACGG；

BMP3反向引物包括：

SEQ ID NO.4：CCCAACAACTACGCGAACC；

SEQ ID NO.5：CGAAATAACGACCAACCCCAC；

SEQ ID NO.6：AAACCCGAAACGCGACC；

BMP3探针包括：

SEQ ID NO.7：5’-TCGGGTTATATACGTCGCGA-3’；

SEQ ID NO.8：5’-TCGGGTTATATACGTCGCGA-3’；

SEQ ID NO.9：5’-GTGAGGTTCGCGTAGTTGTTG-3’，探针均标记FAM；

BMP3阳性质控的阳性标准物为含有SEQ ID NO.10的核苷酸序列；GTTAGTTTGGTCGGGTGTTTTTAAAAATAAAGCGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATTCGGGTTATATACGTCGCGATTTATAGTTTTTTTTTAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCGTAGCGTTTTGCGCGGGTGAGGTTCGCGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTGCGTTGGGTTAGCGTAGTAAGTGGGGTTGGTCGTTATTTCGTTGTATTCGGTCGCGTTTCGGGTTTCGTGCGTTTTCGTTTTAG；

BMP3阴性质控的阴性标准物为含有SEQ ID NO.11的核苷酸序列；GTTAGTTTGGTTGGGTGTTTTTAAAAATAAAGTGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATTTGGGTTATATATGTTGTGATTTATAGTTTTTTTTTAGTGTTGGAGTGGAGATGGTGTTTGTAGTGTTTTGTGTGGGTGAGGTTTGTGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTGTAGTAAGTGGGGTTGGTTGTTATTTTGTTGTATTTGGTTGTGTTTTGGGTTTTGTGTGTTTTTGTTTTAG；

正向内部质控引物为SEQ ID NO.12：TTGTGGATTTTATTATTAYGAAATGG；

反向内部质控引物为SEQ ID NO.13：AAACTACATCTACCTTAAACCCAACC；

内部质控探针为核苷酸序列SEQ ID NO.14：5’-GTATTTTATTTATGGTTATTTTAGAGGGT-3’，标记JOE；

内部质控的标准物为含有SEQ ID NO.15的核苷酸序列：AGAAAAGATTTGTGGATTTTATTATTACGAAATGGCGGTATTTTATTTATGGTTATTTTAGAGGGTAGGTTTTTTTAATGGGTTTGTTTGTTATGTTTAACGTTTTTGGTTGGGTTTAAGGTAGATGTAGTTTAAATTTTTATTAAAATTGTCGAG；

步骤三，将提取的基因组DNA经过转化液处理，以便将DNA中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变；

步骤四，将转化液处理后的DNA进行定量PCR检测；

步骤五，数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线值线，所述阈值值线为刚好超过正常阴性对照的最高点的值，根据实际情况调节Threshold至FAM和JOE扩增曲线升起的拐点处，得到Ct值，计算△Ct值，△Ct＝BMP3目标基因FAM信号的Ct值-B2M内参基因JOE信号的Ct值；

结果判定：首先内部质控B2M基因对应的JOE有明显的扩增曲线且JOE信号的Ct值小于25，则符合要求；阳性质控体系的目标基因BMP3对应的FAM信号有明显的扩增曲线，内部质控B2M基因对应的JOE有明显的扩增曲线的Ct值的差值，即△Ct≤临界值，则符合要求，检测结果正确；

阴性质控体系的FAM无扩增曲线，JOE有明显的扩增曲线且JOE信号的Ct值的差值，即△Ct＞临界值，则符合要求，检测结果正确；

样本判定：△Ct＝BMP3目标基因FAM信号的Ct值-B2M内参基因JOE信号的Ct值≤临界值为发生甲基化样本，判断为结直肠癌早期诊断阳性；△Ct＝BMP3目标基因FAM信号的Ct值-B2M内参基因JOE信号的Ct值>临界值为未发生甲基化样本，判断为结直肠癌早期诊断阴性；所述临界值为BMP3基因检测体系检测浓度为5ng/μL的1％比例甲基化参考品对应的△Ct值。