[发明专利]检测慢病毒质量指标组合的方法及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，特别涉及慢病毒载体的滴度检测方法。公开了一种采用序列特异性引物和荧光染料进行实时荧光定量核酸扩增检测(qPCR和RT‑qPCR)的质量指标检测方法、所用引物、标准品。该测定方法高效，准确，操作容易，样品用量小，重复性佳，解决了真核生物基因工程和基因治疗领域的载体定量不准确的限制问题。具有检测时间短，操作步骤简便，而且不需要扩增后的分析过程，与Taqman探针方法比较，SYBR Green I不需要设计合成荧光探针，简化了设计，且降低了成本，结合溶解曲线分析，可判断反应的特异性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及慢病毒载体的滴度检测方法。

背景技术

慢病毒载体是一种反转录病毒载体，与传统的病毒载体相比，慢病毒载体均匀分布于基因组内，从而降低了其激活宿主内源性基因的几率。病毒载体是目前应用最广泛的基因运载工具之一，在基因治疗研究和转基因动物的制备中已显示出其广阔的应用前景。

现有技术中，测定慢病毒滴度的主要方法有流式细胞术(FACS)、酶联免疫(ELISA)法、金标试纸法和定量PCR法。其中FACS法是该方法可准确测定重组慢病毒的实际感染能力，所测滴度数据能准确反应病毒滴度的实际值，但该方法需要重组慢病毒表达标记基因(如绿色荧光蛋白eGFP)，不能测定无标记基因重组慢病毒。ELISA法仅仅测定慢病毒的颗粒数，并没有测定慢病毒对靶细胞的实际感染能力，因此ELISA法测定的是慢病毒的物理滴度而非实际(生物)滴度。此外，由于病毒悬液中含有一定的游离的P24蛋白，因此ELISA法通常过高地估计病毒滴度。绝对定量PCR法可测定病毒感染的靶细胞中平均每个细胞基因组中病毒基因组的拷贝数，可在一定程度上较准确地反应慢病毒、尤其是无标记基因的慢病毒的实际滴度。但该方法样本需求量大，影响因素多，数据重复性差，对于不能在体外大量增殖培养的靶细胞并不适宜。

慢病毒制备的过程中，通常用病毒的滴度来衡量慢病毒的质量。包括慢病毒滴度在内的慢病毒质量指标的准确测定成为基因治疗领域的技术发展的限制环节。基因治疗生物技术领域仍需要开发一种高效，准确，操作容易，样品用量小，重复性佳的慢病毒质量指标测定方法。

发明内容

为实现本发明开发一种采用序列特异性引物和荧光染料进行实时荧光定量核酸扩增检测(qPCR和RT-qPCR)的高效，准确，操作容易，样品用量小，重复性佳的慢病毒质量指标测定方法的目的，本发明采用如下技术方案

本发明的第一方面提供了一种检测慢病毒质量指标的方法，包括步骤：

(一)针对慢病毒质量指标组合中各指标的特异性引物对组合的制备；1.设计针对慢病毒质量指标组中各指标的特异性引物对组合；

2.在实时荧光定量PCR仪(qPCR仪)上，根据溶解曲线筛选出特异性引物。

(二)标准曲线的制作；

其中，所述慢病毒质量指标组合包括病毒RNA总拷贝数、T细胞总拷贝数、有复制能力的慢病毒拷贝数和宿主细胞基因组DNA残留。

所述步骤(二)标准曲线的制作包括步骤

1.准备针对慢病毒质量指标组中各指标的标准品原料

2.根据以下公式，计算出初始标准品拷贝数/μL：

3.首先通过梯度稀释制备组合中每一标准品的一系列不同拷贝数的稀释标准品，形成不同标准品原料的系列稀释标准品组合；

4.标准曲线的制作:用特异性引物测定步骤3所得系列标准品的qPCR荧光数值，分别用各质量指标拷贝数的对数值为横坐标，用测定的所述标准品组合中各稀释度的标准品的qPCR荧光数值作为纵坐标制作标准曲线做出标准曲线。