[发明专利]3-吡唑基酪氨酸翻译系统及其应用有效
| 申请号： | 201210285659.7 | 申请日： | 2012-08-10 |
| 公开（公告）号： | CN103571804A | 公开（公告）日： | 2014-02-12 |
| 发明（设计）人： | 王江云;刘晓红;李家松;董建树;胡诚;龚为民;江欢欢 | 申请（专利权）人： | 中国科学院生物物理研究所 |
| 主分类号： | C12N9/10 | 分类号： | C12N9/10;C12N1/21;C12N15/11;C12P21/00;C12P21/02;C07K14/00;C07D231/12 |
| 代理公司： | 中科专利商标代理有限责任公司 11021 | 代理人： | 陈晓娜 |
| 地址： | 100101*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 吡唑 酪氨酸 翻译 系统 及其 应用 | ||
【权利要求书】：
1.一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：3所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。
2.一种3-吡唑基酪氨酸翻译系统，所述系统包含：
(i)3-吡唑基酪氨酸；
(ii)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；和
(iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-吡唑基酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA。
3.如权利要求2所述的翻译系统，其还包含(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。
4.如权利要求2所述的翻译系统，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述选择密码子是琥珀密码子，并且其还包含编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
5.一种宿主细胞，其包含所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列，并且该所述宿主细胞是真细菌细胞，优选大肠杆菌细胞。
6.一种产生在至少一个所选位置定点特异插入3-吡唑基酪氨酸的突变蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)提供权利要求3所述的3-吡唑基酪氨酸翻译系统，该系统包含：
(i)3-吡唑基酪氨酸；
(ii)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；
(iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-吡唑基酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和
(iv)编码所述目标蛋白质的核酸，其中所述核酸在所选的位置包含所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子；和
(b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列转化到适当的宿主细胞中，然后将编码所述目标蛋白质的核酸转化到所得到的宿主细胞中，在培养基中加入3-吡唑基酪氨酸，在所述蛋白质的翻译期间，3-吡唑基酪氨酸氨酰化的正交tRNA对所述选择密码子起反应而将培养基中的3-吡唑基酪氨酸定点特异插入所述目标蛋白质的所述所选位置，从而产生在所选位置含3-吡唑基酪氨酸的所述目标蛋白质。
7.生产含有3-吡唑基酪氨酸的绿色荧光蛋白突变体的方法，其利用权利要求6所述的方法，其中所用的编码绿色荧光蛋白突变体的核酸序列分别为SEQ ID NO：8，10，12，在野生型绿色荧光蛋白的149位，151位和182位分别引入3-吡唑基酪氨酸，所述绿色荧光蛋白突变体的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：7，9，11。
8.由权利要求7所述的方法获得的含有3-吡唑基酪氨酸的绿色荧光蛋白突变体，其氨基酸序列选自SEQ ID NO：7，9或11。
9.由权利要求8获得的绿色荧光蛋白突变体及其螯合铜离子后形成的复合物的高分辨率晶体结构，其中所述绿色荧光蛋白突变体的核酸序列为SEQ ID NO：8，10，12，氨基酸序列分别为SEQ ID NO：7，9，11。
10.一种高效的3-吡唑基酪氨酸(pyTyr)的合成方法，其包括下述两个步骤：
第一步：在50ml圆底烧瓶中加入2.46g 3-碘代酪氨酸，溶于20ml 10％NaOH水溶液中，另取1.92g t-Boc酸酐溶于20ml THF中后，将其滴加于3-碘代酪氨酸NaOH溶液中，室温下搅拌过夜，停止反应后，加入适量的盐酸，调节pH值至6.5-7.0之间，然后用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相进行旋蒸，可得到2.94g的Boc-L-3-碘代酪氨酸；
第二步：取一干净的50ml三口瓶，加入0.34g吡唑，1.92g无水Cs2CO3，0.019g CuI，2.03g Boc-L-3-碘代酪氨酸和8ml无水DMF，在氮气保护的条件下，搅拌并于180℃回流18小时，冷却后，旋干DMF，用无水乙醇溶解并抽滤沉淀，取滤液加浓盐酸至沉淀完全，然后再进行抽滤，旋干滤液，用乙酸乙酯和蒸馏水进行萃取，收集水相，用制备型HPLC进行分离纯化。
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- 2017-06-29 - 2019-09-03 - C12N9/10
- 本发明公开了一种肝素前体合酶及其应用，属于生物工程技术领域。本发明将大肠杆菌K5来源的肝素前体合酶KfiC、KfiA在枯草芽孢杆菌中进行三种方式的改造，即两个合酶直接融合；两个合酶通过柔性linker连接；将KfiC、KfiA中关键区域置换多杀巴斯德杆菌来源的PmHS合酶的关键区域，从而得到了三种肝素前体合酶，并获得了肝素前体产量提高、分子量减小的结果。本发明为食品级微生物高效生产制备肝素前体奠定了一定的基础，适合于工业化生产应用。
- 用于获得1-蔗果三糖的方法-201380059189.5
- E·R·比雷茨克鲁兹;L·赫尔南德兹加西亚;D·玛蒂纳茨加西亚;L·E·特鲁吉罗托雷多;C·门内德兹罗德里古兹;A·索布里诺莱翁;R·伊巴涅斯伊巴内兹;G·费霍科斯塔;J·M·乐玛罗蒂西欧 - 遗传工程与生物技术中心
- 2013-09-18 - 2019-09-03 - C12N9/10
- 本发明公开了通过使用在非解糖酵母宿主中组成性地表达的分离自苇状羊茅(Festuca arundinacea)的重组果糖基转移酶(FTF)来以工业规模获得1‑蔗果三糖的方法。在本发明中，组成性地、稳定地和以高水平产生蔗糖:蔗糖1‑果糖基转移酶类型的重组FTF(1‑SSTrec)，在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株的培养物的上清液以及细胞沉淀物中。因此，本发明还提供了用于以工业规模获得1‑SST的方法。所得的重组酶用于从蔗糖开始大量地酶促产生果寡糖(FOS)，尤其是1‑蔗果三糖。本发明的方法允许高于55％的FOS转化率，其中1‑蔗果三糖占大于90％。
- 生产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物和使用其生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法-201480058097.X
- 崔秀真;金素影;徐昌一;申容旭;梁荣烈;严惠媛;朴惠民;全成后;郑炳勋 - CJ第一制糖株式会社
- 2014-10-22 - 2019-09-03 - C12N9/10
- 本发明涉及多肽，表达多肽的产O‑琥珀酰高丝氨酸的微生物，和使用其生产O‑琥珀酰高丝氨酸的方法，所述多肽对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸O‑琥珀酰转移酶活性。
- 通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法-201910481340.3
- 高海燕;周迎卓;甄超颖;王珂 - 上海大学
- 2019-06-04 - 2019-08-30 - C12N9/10
- 本发明公开了一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ‑谷胺酰转肽酶的方法，以该菌株为出发菌株，包括以下步骤：取液体培养基置于三角瓶中，按1‑10％v/v的接种量接入菌体种子，进行摇瓶发酵，发酵条件为20‑40℃，100‑300rpm，发酵培养48h后，将发酵液离心去除菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ‑谷胺酰转肽酶，所述液体培养基包括麦芽糖、玉米粉、酵母膏和无机盐，所述无机盐浓度比为1：5‑5：1的MgSO4·7H2O和K2HPO4·3H2O混合物。该发酵工艺方法通过优化培养基种类和浓度，获得了较高活性和抑菌作用的γ‑谷胺酰转肽酶。该制备工艺简单、条件易控制,适合工业化生产。
- 一种氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体-201910439470.0
- 刘龙;陈坚;堵国成;宋阳;顾洋;李江华;赵雅雯 - 江南大学
- 2016-09-29 - 2019-08-23 - C12N9/10
- 本发明公开了一种氨基葡萄糖‑6磷酸合成酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明采用定点饱和突变氨基葡萄糖‑6‑磷酸合成酶的方法提供了来源于E.coli的氨基葡萄糖‑6‑磷酸合成酶突变体。相比野生型氨基葡萄糖‑6‑磷酸转移酶，突变体对6‑磷酸果糖的催化活力明显提高，乙酰氨基葡萄糖的产量更高，更适合工业化生产。
- 一种氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体-201910439712.6
- 刘龙;陈坚;堵国成;宋阳;顾洋;李江华;赵雅雯 - 江南大学
- 2016-09-29 - 2019-08-23 - C12N9/10
- 本发明公开了一种氨基葡萄糖‑6磷酸合成酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明采用定点饱和突变氨基葡萄糖‑6‑磷酸合成酶的方法提供了来源于E.coli的氨基葡萄糖‑6‑磷酸合成酶突变体。相比野生型氨基葡萄糖‑6‑磷酸转移酶，突变体对6‑磷酸果糖的催化活力明显提高，乙酰氨基葡萄糖的产量更高，更适合工业化生产。
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