[发明专利]一种粉末状小麦芽内切-β-(1,4)-D-木聚糖酶的生产方法

摘要

本发明涉及一种小麦芽内切‑β‑(1,4)‑D‑木聚糖酶的生产方法，本发明以小麦芽为主要原料，粉碎后经缓冲溶液提取得到木聚糖内切酶粗酶，分别经硫酸铵沉淀、Q‑Sepharose Fast Flow阴离子色谱、Phenyl‑Sepharose 6F F疏水柱、Sephacryl S‑100HR凝胶柱层析后冷冻干燥获得内切‑β‑(1,4)‑D‑木聚糖酶粉，经SDS‑page检测电泳条带单一，分子量为27.8KDa。本发明首次获得小麦源内切‑β‑(1,4)‑D‑木聚糖酶，且纯度高，比活高。可用于啤酒酿造业等食品加工业，具有重大的经济效益。

主权项

一种粉末状小麦芽内切‑β‑(1,4)‑D‑木聚糖酶的生产方法，其特征在于步骤如下：1)将小麦芽磨碎，磨筛孔径0.2mm，得到小麦芽粉；向小麦芽粉中按照质量体积比1:4加入0.05M pH7.0的磷酸盐缓冲液，冰水浴中搅拌30min，将搅拌后的混合液用0.05M pH7.0的磷酸盐缓冲液定容至所述小麦芽粉质量的5倍；5000rpm、4℃下离心15min，收集上清液为E‑1；2)冰水浴并磁力搅拌条件下向所述E‑1中加入40％饱和度的硫酸铵；待硫酸铵完全溶解后于4℃静置1个小时，5000rpm、4℃下离心10min，收集上清液为E‑2，并记录E‑2的体积；3)向所述E‑2中加入60％饱和度的硫酸铵，待硫酸铵完全溶解后于4℃静置1个小时，5000rpm、4℃离心10min；将离心后的沉淀用0.02M pH8.3的Tris‑HCl缓冲液复溶至体积为所述小麦芽粉质量的1/5，记作E‑3；E‑3用0.02M pH8.3的Tris‑HCl缓冲液4℃下透析，透析袋截留分子量3500Da，每隔4h换一次透析液，透析至用氯化钡(BaCl₂)进行检验无沉淀产生；透析完毕的酶蛋白溶液为E‑4；4)所述E‑4用Q‑Sepharose Fast Flow阴离子色谱交换柱进一步分离，平衡缓冲液选用20mmol/L、pH 8.3的Tris‑HCl，流速为4.0mL/min；3倍柱体积平衡离子交换层析柱后，将E‑4上样，用1个柱体积的平衡缓冲液洗脱，采用平衡缓冲液继续洗脱，收集280nm处有紫外吸收的洗脱液为E‑5；E‑5在50mmol/L、pH 7.0磷酸缓冲溶液中4℃透析，透析袋截留分子量3500Da，每隔4h换一次透析液，透析4次，记录透析完成后E‑5的体积，并在透析完成后的E‑5中加入硫酸铵固体，至透析后E‑5中硫酸铵浓度达到0.6mol/L，得到样液为E‑6；5)用Phenyl‑Sepharose 6Fast Flow疏水柱对所述E‑6进行分离，平衡缓冲液选用含0.6M硫酸铵的50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液，流速为3.0mL/min；疏水层析柱3倍柱体积平衡后，将E‑6上样，用1个柱体积的平衡缓冲液洗脱，分别用含有0.5mol/L、0.4mol/L、0.3mol/L硫酸铵的50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液进行梯度洗脱，上述每个浓度的磷酸缓冲溶液分别用1个柱体积洗脱，流速为3.0mL/min；然后继续用含0.2mol/L硫酸铵的50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液洗脱，并开始收集280nm处有紫外吸收的洗脱液，并用去离子水在4℃下透析，透析袋截留分子量3500Da，每隔4h换一次透析液，透析4次，得到E‑7；6)用Sephacryl S‑100HR凝胶柱对所述E‑7进行分离纯化，用含0.15mol/L NaCl的50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液作为平衡缓冲液，3倍柱体积平衡后将E‑7上样，继续用所述磷酸缓冲溶液洗脱，流速为1.0mL/min，收集280nm处有紫外吸收的洗脱液，用去离子水4℃下透析，透析袋截留分子量3500Da，冷冻干燥得到小麦芽内切‑β‑(1,4)‑D‑木聚糖酶。