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[发明专利]一种单细胞转录组体外扩增方法-CN202111682168.1在审
发明人：曾凡一;王云杰;马晴雯;黄淑帧 -专利权人：上海市儿童医院;上海凡翼生物科技有限公司
申请日： 2021-12-28 - 公布日： 2022-03-25 - 主分类号： C12Q1/6844 文献下载
摘要：本发明公开了一种单细胞转录组体外扩增方法。包括如下步骤：首先将单个细胞放入细胞裂解液中，反转录合成第一链cDNA；合成第二链cDNA，在新生成的双链cDNA的两条链的5’端分别加上T3或者SP6和T7RNA聚合酶启动子；分别用T3或SP6和T7等与所加启动子序列对应的RNA聚合酶进行体外转录；最后扩增所得RNA分别用对应的引物进行反转录，得到单链cDNA，单链cDNA混合后，互补的cDNA相互结合，自动合成双链cDNA。本发明的方法较单纯的指数扩增的PCR循环数少，减少因PCR带来的序列偏好性和扩增偏差，与传统体外线性扩增相比，免去合成第二链cDNA的繁琐步骤，能较好地反映出细胞转录组各RNA在起始样品中的数量比例关系。
一种单细胞转录体外扩增方法

[发明专利]一种受体牛的筛选方法-CN202010528112.X在审
发明人：曾凡一;曾溢滔;黄淑帧;邱瑾 -专利权人：上海滔华生物医药科技合伙企业（有限合伙）
申请日： 2020-06-11 - 公布日： 2020-09-15 - 主分类号： A61D17/00 文献下载
摘要：本发明公开了一种受体牛的筛选方法。选择发情0天孕酮≤0.64nmol/L，且4‑8天孕酮2‑9nmol/L的牛为适合胚胎移植受体牛。本发明的方法对自然发情空怀牛、配种牛和胚胎移植受体牛不同生殖周期血液中的孕酮水平进行系统测定，以此为依据来检测跟踪牛的发情情况、并选择适合的移植受体牛，监测配种或胚胎移植受体牛的妊娠情况，建立标准化检测和跟踪方法，为提高配种或受体牛的妊娠率和生产效率提供参考依据。
一种受体筛选方法

[发明专利]基于CRISPR/Cas9技术编辑βIVS-2-654剪接突变的sgRNA-CN202010118283.5在审
发明人：曾凡一;黄淑帧;曾溢滔;鲁丹 -专利权人：上海市儿童医院;上海凡翼生物科技有限公司
申请日： 2020-02-26 - 公布日： 2020-05-19 - 主分类号： C12N15/113 文献下载
摘要：本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9技术编辑βIVS‑2‑654剪接突变的sgRNA、载体及应用。其核苷酸序列表如SEQ ID No：1、SEQ ID No：2或SEQ ID No：3所示。通过显微注射sgRNA和Cas9 mRNA到β654地贫小鼠受精卵中，获得了基因编辑地贫小鼠，其β珠蛋白的mRNA异常剪切得到了纠正，β珠蛋白的表达得到了恢复。基因编辑后的β654地贫小鼠的血液学及病理学等表型得到了显著的改善。因此本发明的CRISPR修复异常剪切系统对基于剪切异常单基病的基因编辑精准治疗，具有重要的临床应用价值。
基于 crispr cas9 技术编辑 ivs 654 剪接突变 sgrna

[发明专利]小鼠胎肝基质细胞构建方法及其在造血辅助中的应用-CN201811145477.3在审
发明人：曾凡一;黄淑帧;薛燕;王沄汉 -专利权人：上海市儿童医院;上海滔华生物医药科技合伙企业（有限合伙）
申请日： 2018-09-29 - 公布日： 2019-03-08 - 主分类号： C12N5/071 文献下载
摘要：本发明公开了一种小鼠胎肝基质细胞构建方法及其在造血辅助中的应用。通过胎肝基质细胞获取及体外培养，骨髓LK细胞分离和细胞骨髓腔内移植的操作步骤完成。本发明制备的胎肝基质细胞在造血重建的早期能促进PLT和RBC的恢复，促进HSC的增殖和快速扩增，这对HSC移植中改善宿主的造血微环境，提升造血重建效率有重要意义。
基质细胞造血胎肝构建小鼠宿主移植体外培养细胞分离重要意义骨髓腔微环境重建扩增制备增殖骨髓应用细胞恢复

[发明专利]一种高活性重组人凝血因子IX融合蛋白及其制备方法-CN201811171804.2在审
发明人：曾凡一;黄淑帧;曾溢滔;严红 -专利权人：上海市儿童医院;上海滔华生物医药科技合伙企业（有限合伙）
申请日： 2018-10-09 - 公布日： 2019-03-08 - 主分类号： C12N15/62 文献下载
摘要：本发明公开了一种高活性重组人凝血因子IX融合蛋白及其制备方法。包括启动子，人凝血因子IX蛋白基因，人免疫球蛋白IgG1的Fc段基因和终止子。本发明利用载体将人FIX‑Fc融合蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物，从转基因动物乳汁中获得人FIX‑Fc融合表达蛋白。依据本发明的方法，在动物乳汁中表达的人FIX活性可达6IU/ml，平均比活可高达3000IU/mg，比天然FIX高约12倍，可用于人凝血因子IX的生产。
重组人凝血因子IX 人凝血因子IX 融合蛋白高活性制备哺乳动物基因组转基因动物乳汁人免疫球蛋白融合表达蛋白基因表达盒转基因动物蛋白基因动物乳汁启动子终止子比活可用转入生产

[发明专利]一种IBMI注射胎肝Ficoll分离单细胞悬液以重建造血的方法-CN201810979803.4在审
发明人：曾凡一;黄淑帧;杨冠恒 -专利权人：上海市儿童医院;上海滔华生物医药科技合伙企业（有限合伙）
申请日： 2018-08-27 - 公布日： 2019-01-11 - 主分类号： C12N5/0786 文献下载
摘要：本发明公开了一种IBMI注射胎肝Ficoll分离单细胞悬液以重建造血的方法。通过胎肝单细胞悬液制备，胎肝HSCs移植的操作步骤，本发明的方法能高效重建血液系统，造血安全、稳定、可靠，且能高质量地对地贫小鼠进行有效治疗，治疗后的血液学参数，病理学指标接近于正常个体，这对于未来临床开发胎肝造血干进行血液性等疾病的高效治疗储备了技术体系基础。
胎肝单细胞悬液造血重建注射血液学参数技术体系血液系统有效治疗正常个体病理学小鼠制备治疗血液移植储备疾病安全开发

[发明专利]一种红系特异高表达GFP的小鼠多能干细胞系及其构建方法-CN201810979591.X在审
发明人：曾凡一;黄淑帧;杨冠恒;曾溢滔 -专利权人：上海市儿童医院;上海滔华生物医药科技合伙企业（有限合伙）
申请日： 2018-08-27 - 公布日： 2019-01-11 - 主分类号： C12N5/10 文献下载
摘要：本发明公开了一种红系特异高表达GFP的小鼠多能干细胞系及其构建方法。所述小鼠多能干细胞系通过显微注射的方式，将红系高表达GFP载体注入昆明白小鼠受精卵的雄原核中，培育转基因鼠，经验证插入性基因在特定组织细胞表达后，对转基因小鼠进行繁殖，待其子代小鼠的外源性基因的拷贝数稳定后，用其囊胚制备而成。本发明的小鼠多能干细胞系对于研究血细胞在体内外的形成衍变具有重要细胞学价值，这有助于揭开造血干的形成，造血微环境的复杂影响作用，同时有且于推动多能性干细胞体外向可移植造血干分化的研究进程。
小鼠高表达红系造血构建昆明白小鼠培育转基因外源性基因转基因小鼠血细胞复杂影响显微注射子代小鼠组织细胞受精卵插入性多能性经验证拷贝数可移植微环境细胞学雄原核囊胚制备繁殖体内分化基因研究进程

[发明专利]一种Tc1iPs细胞系及其构建方法-CN201810979817.6在审
发明人：曾凡一;黄淑帧;杨冠恒;曾溢滔 -专利权人：上海市儿童医院;上海滔华生物医药科技合伙企业（有限合伙）
申请日： 2018-08-27 - 公布日： 2019-01-04 - 主分类号： C12N5/10 文献下载
摘要：本发明公开了一种Tc1iPs细胞系及其构建方法。所述细胞系为采用Yamanaka四因子重编程方法将小鼠唐氏综合征小鼠的尾尖皮肤成纤维细胞制备成的细胞系。本发明建立的Tc1iPS细胞系，作为一种细胞模型，将有助于研究发育早期唐氏综合征的发生发展机制，以及在细胞水平进行相关治疗性研究，以推动胚胎早期唐氏综合症的干预性防治。
唐氏综合征构建小鼠皮肤成纤维细胞唐氏综合症治疗性研究细胞模型细胞水平干预性重编程尾尖制备胚胎发育防治研究

[发明专利]一种小分子羊胎素的提取方法及在护肤品领域的运用-CN201410685145.X在审
发明人：曾凡一;黄淑帧 -专利权人：上海滔滔转基因工程股份有限公司
申请日： 2014-11-26 - 公布日： 2015-03-04 - 主分类号： A61K8/98 文献下载
摘要：本发明公开了属于生物技术领域的一种小分子羊胎素的提取方法及在护肤品领域的运用。其提取方法为采用同期发情获得大量的同期怀孕羊，并在怀孕85-100天时手术法取出胎羊，取躯体匀浆，反复冻融裂解细胞，高温变性、消毒、并沉淀杂蛋白，高速离心后采用30KD超滤去掉大分子杂蛋白及细菌、内源性病毒等有毒有害成分及杂质，获得纯净的小分子羊胎素产品并以1KD的超滤组件对小分子羊胎素产品进行超滤浓缩。本发明的小分子羊胎素可广泛的用于护肤品、美容产品、创伤愈合产品、保健品、科学研究等领域。本发明的方法为羊胎素的生产提供了一个重要的新途径，并首次鉴定了小分子羊胎素的组成成分，并为科学使用羊胎素提供了理论依据。
一种分子羊胎素提取方法护肤品领域运用

[发明专利]一种利用动物乳腺生产人血清白蛋白的方法及其表达载体-CN201210567600.7在审
发明人：曾溢滔;曾凡一;蔡勤;方彧聃;黄淑帧 -专利权人：上海市儿童医院;上海滔滔转基因工程股份有限公司
申请日： 2012-12-24 - 公布日： 2014-07-02 - 主分类号： C12N15/85 文献下载
摘要：本发明公开了一种利用转基因动物的乳腺生产人血清白蛋白的方法及其表达载体。本发明的方法，包括利用载体将人血清白蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物，从转基因动物乳汁中获得人血清白蛋白，所述的人血清白蛋白基因表达盒从5’到3’依次包括启动子、人血清白蛋白基因和终止子，还包括人血清白蛋白基因3’旁侧序列M2和β‑酪蛋白基因的3’旁侧序列B3中的一种或两种，M2或B3位于终止子之后。本发明的方法，在动物的乳汁中人血清白蛋白的浓度至少可达到4.6‑6.7g/L，完全能够达到商业利用的水平。从转基因牛的牛奶中分离获得人血清白蛋白给人血清白蛋白的生产提供了一种低成本，高产量的好方法。
一种利用动物乳腺生产血清白蛋白方法及其表达载体

[发明专利]一种多能干细胞表面标志物及其用途-CN201210082520.2有效
发明人：曾凡一;王琳琳;黄淑帧 -专利权人：上海市儿童医院;上海凡翼生物科技有限公司
申请日： 2012-03-23 - 公布日： 2013-09-25 - 主分类号： C12N5/0735 文献下载
摘要：本发明公开了紧密连接蛋白家族的Cldn6作为多能干细胞表面标志物的新用途及其用于分离多能干细胞的方法。采用本发明的干细胞表面标志物，可以将干细胞由小鼠畸胎瘤的混合细胞系统中分离纯化出来。表达Cldn6可以有效地判断细胞为干细胞，并用于分离干细胞。本发明的干细胞表面标志物特异性及可应用性强，符合干细胞标志的作用和要求。
一种多能干细胞表面标志及其用途

[发明专利]羊基因组中被噬菌体φC31整合酶识别的DNA及其应用-CN201110024397.4有效
发明人：曾溢滔;马海燕;黄淑帧 -专利权人：上海市儿童医院;上海滔滔转基因工程股份有限公司
申请日： 2011-01-21 - 公布日： 2012-07-25 - 主分类号： C12N15/11 文献下载
摘要：本发明公开了羊基因组中被噬菌体φC31整合酶识别的DNA。本发明从羊基因组中分离了4个假attP位点，进而能够将φC31整合酶系统应用在转基因羊生产制备中，使外源目的基因高效整合于羊基因组中并高效表达。
基因组噬菌体 c31 整合识别 dna 及其应用

[发明专利]一种人转铁蛋白的表达载体及其构建方法和应用-CN200910199816.0无效
发明人：曾溢滔;颜景斌;黄淑帧 -专利权人：上海市儿童医院;上海滔滔转基因工程股份有限公司
申请日： 2009-12-02 - 公布日： 2010-09-29 - 主分类号： C12N15/85 文献下载
摘要：本发明涉及一种人转铁蛋白的表达载体及其构建方法和应用，该载体由人转铁蛋白小基因hTF，兔转铁蛋白启动子RP，兔转铁蛋白增强子EP以及去除CMV启动子的pcDNA3.1(-)载体构成，其中EP的数目为一个或两个。装有hTF的载体和装有RP、两个EP的载体连接获得δ3.1-2EP-TFN载体；装有hTF的载体和装有RP、两个EP的载体双酶切，补平、去磷酸化自连接形成的载体连接后形成δ3.1-EP-TFN载体。本发明的人转铁蛋白的表达载体在大鼠肝脏细胞株和转基因小鼠血浆中高效表达人转铁蛋白。
一种铁蛋白表达载体及其构建方法应用

[发明专利]牛基因组假attP位点及其应用-CN200810040472.4有效
发明人：曾溢滔;欧海龙;黄淑帧;黄英 -专利权人：上海市儿童医院;上海滔滔转基因工程股份有限公司
申请日： 2008-07-11 - 公布日： 2010-01-13 - 主分类号： C12N15/11 文献下载
摘要：本发明公开了一个新的牛基因组中链霉菌噬菌体ΦC31整合酶可识别的假attP位点，本发明还提供一种利用该假attP位点的旁侧序列构建的定向整合载体及其构建方法。本发明首先从牛基因组中分离了一个能被高频率整合并高效表达外源基因的假attP位点，该位点位于牛4号染色体。在此基础上，构建含有该假attP位点旁侧序列的特异定向整合载体，使外源基因以90％以上的概率整合于该假attP位点上，并且外源目的基因也能获得高效表达。
基因组 attp 及其应用

[发明专利]一种抽提牛精子线粒体DNA的方法-CN200910051948.9有效
发明人：曾溢滔;周在威;任兆瑞;黄淑帧 -专利权人：上海市儿童医院;上海滔滔转基因工程股份有限公司
申请日： 2009-05-26 - 公布日： 2009-11-11 - 主分类号： C12N15/10 文献下载
摘要：本发明公开了一种抽提牛精子线粒体DNA的方法，该方法采用低渗溶液裂解牛精子。本发明的方法无需昂贵的机器设备，使用常规试剂，操作方法简单易行，解决了从冷冻的牛精子小管中抽提线粒体DNA的难题。
一种抽提牛精子线粒体 dna 方法

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