[发明专利]用于检测链球菌的方法、寡核苷酸和试剂盒

说明书

本发明公布了用于检测链球菌的寡核苷酸、试剂盒和方法，其都涉及用于检测链球菌属基因组中一个保守性区域的第一引物对和第一探针；用于检测B族链球菌基因组中第一个保守性区域的第二引物对和第二探针；用于检测B族链球菌基因组中不同于所述第一个保守性区域的第二个保守性区域的第三引物对和第三探针，采用荧光PCR技术，同时检测链球菌属及其成员B族链球菌，并且在检测B族链球菌时，同时扩增B族链球菌基因组中的两个不同的保守性区域，可以避免漏检。

技术领域

本发明属于生物科学和生物技术领域，特别涉及一种检测链球菌属及B族链球菌的方法、寡核苷酸和试剂盒，采用荧光PCR技术，对临床样本中可能存在的B族链球菌进行多重检测。

背景技术

链球菌属(Streptococcus)是化脓性球菌中的一大类常见的革兰阳性球菌。链球菌属目前有69个种和亚种，广泛分布于自然界、人类和动物的粪便、健康人的鼻咽部等处，大多数并不致病。链球菌在人体中引起的疾病主要有各种化脓性炎症、猩红热、新生儿败血症、细菌性心内膜炎以及风湿热、肾小球肾炎等超敏反应性疾病。

根据在血琼脂培养基上的溶血特征，链球菌属可分为三种不同类型：(1)甲型溶血性链球菌，又称为草绿色链球菌，菌落周围出现草绿色溶血环，通常寄居在人的口咽腔、呼吸道及肠道中，致病力弱，多为条件性致病菌；(2)乙型溶血性链球菌，产生强烈的溶血毒素，在血琼脂培养基上，可使菌落周围出现宽2～4毫米、界限分明、无色透明的溶血环，致病力强，能引起人类和动物患上多种疾病；(3)丙型链球菌，不溶血，菌落周围无溶血环，一般不致病。

根据链球菌的抗原构造不同，又分成A、B、C、D等20个群，在每一群中，因表面蛋白抗原的不同，又分成若干亚群。对人类有致病性的链球菌菌株，90％左右属于A群，B、C、D、G群偶见。

链球菌所致疾病具有复杂而多样的特点，一方面，由于细菌类型多，且既有侵袭力也有毒素；另一方面，人体各组织器官均高度易感，且有变态反应机制参与发病。链球菌产生的侵袭性酶有：透明质酸酶、链激酶和链道酶等；产生的毒素有：链球菌溶血素、红疹毒素。变态反应性疾病如风湿热、急性肾小球性肾炎等，均可由A群链球菌感染引发。

B族链球菌(group B Streptococcus,GBS)，也称为无乳链球菌，是一种常见的革兰阳性链球菌，以其细胞壁中的多糖类C物质属于兰斯菲尔德抗原结构分类中的B群而得名。根据它的荚膜多糖抗原性的不同，B族链球菌又分为9种血清型(Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅷ型)。B族链球菌常存在于直肠与阴道，可引起产妇羊膜腔感染、胎膜早破、胎儿早产、流产等情况。据统计，约10％～30％的孕妇感染B族链球菌，其中40％～70％在分娩过程中会传递给新生儿。如果新生儿携带这种菌，大约有1％～3％会出现早期侵入性感染，发生脑膜炎、肺炎、败血症，其中有5％会导致死亡。相关研究表明，抗菌药物的针对使用可有效地预防产妇胎膜早破等不良妊娠结局的发生。

基于B族链球菌感染引起孕妇和新生儿相关不良症状，产前筛查B族链球菌显得极为重要。2010年美国疾病预防中心指定了《围产期B族链球菌预防指南》，建议孕妇在妊娠35～37周进行B族链球菌筛查。

在过去相当长的时间里，对GBS的诊断主要是通过对孕产妇直肠或阴道拭子、新生儿的血液或脑脊液进行培养来实现的，但是常规的培养方法在检测孕妇B族链球菌感染方面的假阴性率可高达50％。应用选择性培养基可以抑制其他微生物的生长，这种选择性培养一直是确定B族链球菌感染的金标准。但是选择性培养得出阴性结果要72小时，阳性结果至少也要48小时才能得出，所以需要快速检测B族链球菌的方法来弥补这一缺憾。

由于B族链球菌的抗生素预防策略的实施以及抗生素的广泛应用，对轻度感染和经抗生素治疗的患者，传统的培养和血清学检测方法难免会出现敏感性不足的问题，假阴性也时有发生。分子生物学技术的出现和飞速发展，为B族链球菌的快速灵敏诊断提供了新的技术平台。主要有以下几类方法用于对B族链球菌的临床诊断和(或)菌株研究：分子杂交诊断、聚合酶链反应(PCR)及相关技术诊断以及分子生物学分型技术等。