本说明书实施例公开了一种标准化的DNA甲基化检测标准品及其制备方法、定值方法及应用。所述DNA甲基化检测标准品由原始DNA样品和对所述原始DNA样品进行甲基化得到的甲基化DNA样品配制而成,所述原始DNA样品包括目的基因片段、第一核苷酸片段和第二核苷酸片段,所述第一核苷酸片段为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列,所述第二核苷酸片段为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列,所述甲基化DNA样品包括甲基化后的目的基因片段、对所述第一核苷酸片段甲基化后的第三核苷酸片段和对所述第二核苷酸片段甲基化后的第四核苷酸片段,所述第三核苷酸片段为如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列,所述第四核苷酸片段为如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。