本发明提供了一种双孢菇呈味肽及其制备方法和应用。所述的双孢菇呈味肽,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了上述的一种双孢菇呈味肽的制备方法,首先通过高压蒸煮从双孢菇中提取水溶性成分;采用纳滤膜和超滤膜分离截留分子量在200Da和3000Da之间的膜分离组分;对所述膜分离组分进行分离纯化后获得氨基酸序列为如SEQ ID NO.1所示的双孢菇呈味肽。本发明还提供了上述的双孢菇呈味肽在食品中的应用。本发明还提供了一种食品调味料,含有上述的双孢菇呈味肽。本发明的双孢菇呈味肽作为呈味物质的一种,应用于食品领域。本发明研究发现,利用本实施例制备的双孢菇呈味肽进行美拉德反应,能获得具有良好的风味增强效果的双孢菇美拉德反应肽。