[发明专利]一种高特异性的碱基突变PCR检测方法在审
| 申请号： | 201611032111.6 | 申请日： | 2016-11-22 |
| 公开（公告）号： | CN108103157A | 公开（公告）日： | 2018-06-01 |
| 发明（设计）人： | 张乐橦;宋炎;刘磊;刘军;朱红梅;叶明芝 | 申请（专利权）人： | 天津华大医学检验所有限公司;深圳华大基因股份有限公司;广州华大基因医学检验所有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6858 | 分类号： | C12Q1/6858 |
| 代理公司： | 深圳鼎合诚知识产权代理有限公司 44281 | 代理人： | 孙银行;彭家恩 |
| 地址： | 300000 天津市天津自贸区（空港经*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种高特异性的碱基突变PCR检测方法，包括：首先对模板DNA进行巢式PCR富集；然后使用无3’‑5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶，在焦磷酸盐存在的环境下，使用修饰引物进行PCR扩增，修饰引物在模板上对应的位置位于巢式PCR引物的内侧，其3’末端是双脱氧核苷酸，与待检测突变型模板互补而不与正常野生型模板互补，DNA聚合酶依赖模板而焦磷酸解修饰引物的3’末端的双脱氧核苷酸，引物正常延伸，使用实时荧光定量PCR记录扩增曲线，检测Ct值差异。本发明的方法解决了碱基低频突变快速检测中存在的非特异性条带干扰和引物二聚体的问题，提高检测特异性和灵敏度。 | ||
| 搜索关键词： | 修饰引物 双脱氧核苷酸 碱基突变 焦磷酸 检测 实时荧光定量PCR 巢式PCR引物 突变型模板 外切酶活性 引物二聚体 非特异性 焦磷酸盐 快速检测 扩增曲线 巢式PCR 模板DNA 灵敏度 野生型 富集 碱基 条带 引物 突变 延伸 记录 | ||
【主权项】：
1.一种高特异性的碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括：首先对模板DNA进行巢式PCR富集；然后使用无3’-5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶，在焦磷酸盐存在的环境下，使用修饰引物进行PCR扩增，所述修饰引物在模板上对应的位置位于巢式PCR引物的内侧，所述修饰引物的3’末端是双脱氧核苷酸，该3’末端与待检测突变型模板互补而不与正常野生型模板互补，在有待检测突变型模板存在的情况下，所述DNA聚合酶依赖模板而焦磷酸解所述修饰引物的3’末端与模板互补的双脱氧核苷酸，引物正常延伸，使用实时荧光定量PCR记录扩增曲线，检测Ct值差异。
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