[发明专利]一种高特异性的碱基突变PCR检测方法在审
| 申请号： | 201611032111.6 | 申请日： | 2016-11-22 |
| 公开（公告）号： | CN108103157A | 公开（公告）日： | 2018-06-01 |
| 发明（设计）人： | 张乐橦;宋炎;刘磊;刘军;朱红梅;叶明芝 | 申请（专利权）人： | 天津华大医学检验所有限公司;深圳华大基因股份有限公司;广州华大基因医学检验所有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6858 | 分类号： | C12Q1/6858 |
| 代理公司： | 深圳鼎合诚知识产权代理有限公司 44281 | 代理人： | 孙银行;彭家恩 |
| 地址： | 300000 天津市天津自贸区（空港经*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 修饰引物 双脱氧核苷酸 碱基突变 焦磷酸 检测 实时荧光定量PCR 巢式PCR引物 突变型模板 外切酶活性 引物二聚体 非特异性 焦磷酸盐 快速检测 扩增曲线 巢式PCR 模板DNA 灵敏度 野生型 富集 碱基 条带 引物 突变 延伸 记录 | ||
1.一种高特异性的碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括：首先对模板DNA进行巢式PCR富集；然后使用无3’-5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶，在焦磷酸盐存在的环境下，使用修饰引物进行PCR扩增，所述修饰引物在模板上对应的位置位于巢式PCR引物的内侧，所述修饰引物的3’末端是双脱氧核苷酸，该3’末端与待检测突变型模板互补而不与正常野生型模板互补，在有待检测突变型模板存在的情况下，所述DNA聚合酶依赖模板而焦磷酸解所述修饰引物的3’末端与模板互补的双脱氧核苷酸，引物正常延伸，使用实时荧光定量PCR记录扩增曲线，检测Ct值差异。
2.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述修饰引物是预先合成的3’末端缺少所述双脱氧核苷酸的寡核苷酸，在末端脱氧核苷酸转移酶和ddNTP的存在下，将双脱氧核苷酸加到所述寡核苷酸的3’末端而得到的引物。
3.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述模板DNA是基因组DNA。
4.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述碱基突变是替换、插入或缺失。
5.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述方法用于多种体液样本的基因检测。
6.根据权利要求5所述的高特异性的碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述多种体液样本包括血浆、癌组织、脑脊液、胸腔积液、唾液、腹水、脱落细胞和淋巴液。
7.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述方法用于组织样本的基因检测。
8.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述方法用于恶性肿瘤相关体细胞突变的基因检测。
9.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述修饰引物的5’端连接公共序列，所述PCR扩增之后利用所述公共序列进行大量扩增。
10.根据权利要求9所述的高特异性的碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述公共序列中插入用于区别不同样本的标签序列，所述PCR扩增之后将来源于不同样本的PCR扩增产物混库进行高通量测序。
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