[发明专利]一种高特异性的碱基突变PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种高特异性的碱基突变PCR检测方法，包括：首先对模板DNA进行巢式PCR富集；然后使用无3’‑5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶，在焦磷酸盐存在的环境下，使用修饰引物进行PCR扩增，修饰引物在模板上对应的位置位于巢式PCR引物的内侧，其3’末端是双脱氧核苷酸，与待检测突变型模板互补而不与正常野生型模板互补，DNA聚合酶依赖模板而焦磷酸解修饰引物的3’末端的双脱氧核苷酸，引物正常延伸，使用实时荧光定量PCR记录扩增曲线，检测Ct值差异。本发明的方法解决了碱基低频突变快速检测中存在的非特异性条带干扰和引物二聚体的问题，提高检测特异性和灵敏度。

技术领域

本发明涉及基因突变检测技术领域，尤其涉及一种高特异性的碱基突变PCR检测方法。

背景技术

在等位基因特异性PCR(allele specific PCR,AS-PCR)技术出现之前，常用检测基因突变的方法是PCR富集突变点序列进行Sanger测序检测多种突变，Sanger测序的质量对片段长度有要求，大于100bp且突变位点在序列中部，检测结果较为准确，对于100bp以下的小片段常常出现测序质量低的问题；另外Sanger测序的灵敏度能检测≥5％的基因突变，显然不能满足游离DNA短片段低频突变的检测要求。

AS-PCR利用碱基错配阻滞扩增的原理，设计特异的正向引物和远端反向引物，引物3’端与SNP的突变型基因型相同，只有突变型模板能被扩增，野生型模板无法扩增。增加了扩增反应的特异性，突变型模板信号被放大，灵敏度达到1％。这种方法可以用来检测基因频率≤10％的突变。特异性低于2.5％。

2000年，Liu和Sommer在AS-PCR基础上进行改进，将引物3’端脱氧核苷酸dNMP更换为双脱氧核苷酸ddNMP，使用无3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶，只有3’末端与模板匹配的引物才能进行扩增，这种扩增依赖焦磷酸解反应的激活，称为焦磷酸解激活聚合反应(Pyrophosphorolysis-activated polymerization，简称PAP)。与传统的AS-PCR相比，这一改进显著增加了扩增特异性(Qin,J.,et al.,The Molecular Anatomy of SpontaneousGermline Mutations in Human Testes.PLoS Biology,2007.5(9):p.e224)。

现有技术存在以下缺点：(1)非特异性，由于PCR错配概率为10-7～10-5，有校正功能的聚合酶可以将错配的3’端切除，进行模板依赖性扩增，产生非特异性扩增产物，导致假阳性；(2)异质性，针对恶性肿瘤体细胞突变的检测样本DNA多采集自肿瘤组织，存在取样位置不同产生的异质性问题。

发明内容

本发明旨在解决碱基低频突变快速检测中存在的野生型背景竞争性扩增与体液样本存在扩增抑制的问题，提高检测特异性和灵敏度；可针对肿瘤患者或健康人的多种样本DNA进行检测，非侵入式的采样方式，更适合健康人群早筛，以及术后用药检测。

因此，本发明提供一种高特异性的碱基突变PCR检测方法，包括：首先对模板DNA进行巢式PCR富集；然后使用无3’-5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶，在焦磷酸盐存在的环境下，使用修饰引物进行PCR扩增，上述修饰引物在模板上对应的位置位于巢式PCR引物的内侧，上述修饰引物的3’末端是双脱氧核苷酸，该3’末端与待检测突变型模板互补而不与正常野生型模板互补，在有待检测突变型模板存在的情况下，上述DNA聚合酶依赖模板而焦磷酸解上述修饰引物的3’末端与模板互补的双脱氧核苷酸，引物正常延伸，只有突变型模板扩增，使用实时荧光定量PCR记录扩增曲线，检测Ct值差异。

进一步地，上述修饰引物是预先合成的3’末端缺少上述双脱氧核苷酸的寡核苷酸，在末端脱氧核苷酸转移酶和ddNTP的存在下，将双脱氧核苷酸加到上述寡核苷酸的3’末端而得到的引物。