[发明专利]一种谷氨酸棒状杆菌及采用谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-缬氨酸的方法

说明书

本发明公开了一种谷氨酸棒状杆菌及采用谷氨酸棒状杆菌发酵生产L‑缬氨酸的方法。本发明通过对谷氨酸棒状杆菌的筛选诱变，并对其进行改造，最终构建了一株可用于工业生产的谷氨酸棒状杆菌，最终发酵罐产量达到51.6g/L。并对发酵培养基的中维生素B3进行优化，提高了L‑缬氨酸的产量，最终发酵产量达到了68.2g/L。本发明采用两阶段发酵，降低成本的同时提高了L‑缬氨酸的产量和转化率。最终在5L发酵罐上发酵48h，L‑缬氨酸产量、转化率和生产强度分别达到了100g/L、44％和2.08g/L/h。本发明所得菌株潜力巨大，且发酵生产L‑缬氨酸的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，适用于工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种谷氨酸棒状杆菌及采用谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-缬氨酸的方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术

L-缬氨酸(L-valine)，属于分支链氨基酸(branched chain amino acids,BCAA)，是人体必需氨基酸之一，分子式C₅H₁₁NO₂，密度1.316g/cm3，白色结晶或粉末，溶于水，在水中溶解度：0℃为83.49g/L，25℃为88.5g/L，且缬氨酸分子是手性分子，根据偏振光的旋转方向分为D型和L型，天然的缬氨酸都为L-缬氨酸。

L-缬氨酸是人体必需氨基酸之一，不能通过自身合成，必须依赖外源供给，L-缬氨酸具有多种生理功能，广泛应用于医药、食品、饲料等领域。在医药行业，L-缬氨酸是制造复合氨基酸药物的重要原料，主要用于血脑、肝脏、代谢缺陷、创伤愈合、营养支持等的治疗，效果显著；在食品行业中，例如在能量饮料中添加L-缬氨酸可以促进肌肉形成、减轻肌肉，在面包糕点等食物中添加L-缬氨酸可以有效的改善口感；在饲料行业中，L-缬氨酸可用于饲料添加剂，在促进乳腺组织发育、改善泌乳功能、调节糖代谢等方面有重要作用。

目前，L-缬氨酸的工业生产方法主要有直接提取法、化学合成法和微生物发酵法。微生物发酵法有产量稳定、反应条件温和、生产成本低等诸多优点，是目前世界上L-缬氨酸生产的主要方法。谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)属于放线菌目棒状杆菌属。是一种无芽孢的、细胞呈短小棒状八字排列的革兰氏阳性细菌。谷氨酸棒状杆菌有易培养、不产孢子等诸多优点，作为食品安全级的微生物，是一类重要的工业生产菌株，可用于生产包括L-缬氨酸在内的多种氨基酸。

当前谷氨酸棒状杆菌中L-缬氨酸的生物合成路径已经明确。葡萄糖经过糖酵解途径生成的丙酮酸，是L-缬氨酸合成的重要前体物质，丙酮酸再通过4步反应即可合成L-缬氨酸：首先由ilvBN基因编码的乙酰羟酸合酶将两分子的丙酮酸缩合成2-乙酰羟酸，然后在ilvC基因编码的乙酰羟酸还原异构酶催化下转化为2,3-二羟基异戊酸，再由ilvD基因编码的二羟酸脱水酶将2,3-二羟基异戊酸脱水形成2-酮基异戊酸，最后由ilvE基因编码的支链氨基酸转氨酶将2-酮基异戊酸转化成L-缬氨酸。最后通过brnFE基因编码的转运蛋白复合体BrnFE转运至胞外。

目前，借助单一代谢工程策略改造获得的工程菌株，其L-缬氨酸生产水平较低，仍然面临着产酸率低，糖醋转化率低，副产物高等问题，不能满足工业化生产需求。因此，需要从遗传背景清晰的菌株出发，全面的对代谢途径进行优化，以期获得能够满足工业化生产需求的菌株。但是目前常使用一些菌株，比如C.glutamicum ATCC13869和14067，以及自然筛选得到的菌株，全基因组序列未知，遗传背景不清晰，不利于后期的代谢改造。C.glutamicum R JCM 18229遗传性状稳定，背景清晰，是用于代谢改造的优良菌株。

发明内容