[发明专利]一种谷氨酸棒状杆菌及采用谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-缬氨酸的方法

权利要求书

1.一种谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌是在谷氨酸棒状杆菌FMME-446中，进行如下改造：

过表达了6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶；以及，

敲除了乳酸脱氢酶、磷酸转乙酰基酶、丙氨酸合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；以及，

采用启动子P_gapA串联表达乙酰羟酸合酶的编码基因ilvBN^M与乙酰羟酸还原异构酶的编码基因ilvC^SM；以及，

将NADH依赖型亮氨酸脱氢酶插入IlvE位点；

其中，谷氨酸棒状杆菌FMME-446，于2023年2月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2023147，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述乙酰羟酸合酶和乙酰羟酸还原异构酶经过突变改造，突变后的乙酰羟酸合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，突变后的乙酰羟酸还原异构酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，编码NADH依赖型亮氨酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，过表达6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶将6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的启动子替换为Ptac启动子。

5.一种采用权利要求1～4任一项所述的谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-缬氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将种子液接种至发酵培养基中，在温度28～32℃，pH 7.0～7.5，初始通气量0.8～1.2vvm，溶解氧不低于20％条件下进行发酵；

发酵至8～10h时改为微溶氧发酵，通气量降低到0.1～0.3vvm，转速降低到100～200r/min；

分别在14～16h时将糖补至85～95g/L，22～26h时将糖补至75～85g/L，34～38h时将糖补至55～65g/L。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中包括20～40mg/L维生素B3。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括6～10g/L(NH₄)₂SO₄，0.8～1.2g/LKH₂PO₄，0.8～1.2g/L K₂HPO₄，0.4～0.6g/L MgSO₄·7H₂O，1.6～2.0g/L酵母粉，8～12mg/L FeSO₄·7H₂O，3～5mg/LMnSO₄·H₂O，0.01～0.03mg/L生物素，1～3mg/L维生素B1，20～40mg/L维生素B3，40～60mg/L卡那霉素，80～100g/L葡萄糖，消泡剂0.8～1.2mL/L。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子液的接种量按体积比为6～10％。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子液是所述谷氨酸棒状杆菌经过斜面培养、一级摇瓶种子培养和二级摇瓶种子培养获得。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，一级摇瓶种子培养基包括2.4～2.6g/L尿素，4～6g/L(NH₄)₂SO₄，0.4～0.6g/LKH₂PO₄，0.4～0.6g/L K₂HPO₄，0.4～0.6g/L MgSO₄·7H₂O，1.6～2.0g/L酵母浸出粉，4～6g/L蛋白胨，5～7mg/L FeSO₄·7H₂O，3～5mg/L MnSO₄·H₂O，0.1～0.3mg/L生物素，0.1～0.3mg/L维生素B1，40～60mg/L卡那霉素，30～50g/L葡萄糖；

二级摇瓶种子培养基包括6～10g/L(NH₄)₂SO₄，0.6～1.0g/L KH₂PO₄，0.6～1.0g/LK₂HPO₄，0.4～0.6g/L MgSO₄·7H₂O，1.6～2.0g/L酵母粉，8～12mg/L FeSO₄·7H₂O，3～5mg/LMnSO₄·H₂O，0.01～0.03mg/L生物素，1～3mg/L维生素B1，40～60mg/L卡那霉素，30～50g/L葡萄糖。