[发明专利]番茄褪绿矮缩类病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测荧光探针、试剂盒及应用

说明书

本发明属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种番茄褪绿矮缩类病毒TaqMan实时荧光定量RT‑PCR检测荧光探针、试剂盒及应用。本技术方案所涉及的引物的核苷酸序列为：正向引物：5'‑GGGTTTTCACCCTTCCTTTC‑3'，反向引物：5'‑TGTTTCWRCDGGGATTACTCCTG‑3'；荧光探针的序列为：5'‑FAM‑CGCCTTCCACAAGCTCCCTGCCGCCTTT‑BHQ1‑3'；试剂盒至少包括上述的引物和荧光探针。本发明提供的番茄褪绿矮缩类病毒荧光定量PCR检测方法操作方便且快速，可对番茄褪绿矮缩类病毒进行定量检测，该引物的特异性好，灵敏度高，适合于在植物病害诊断领域广泛推广应用。

技术领域

本发明属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种番茄褪绿矮缩类病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测荧光探针、试剂盒及应用。

背景技术

茄科植物包括番茄(Lycopersicon esclulantum Mill)、马铃薯(Solanumtuberosum L.)、辣椒(Capsicum annuum L.)、烟草(Nicotiana tabacum L.)等重要蔬菜、经济和大田作物，在世界范围内广泛栽培，具有重要的经济价值。特别是马铃薯和番茄，分别是世界第一和第二大具有经济要性的蔬菜，在全世界173个国家种植。但茄科植物也是重要的病毒和类病毒寄主，被病毒或类病毒侵染后产量或品质降低，造成严重的经济损失。类病毒是一类环状闭合的单链RNA分子，分子量约105Da，含246～401个核苷酸。类病毒是比已知病毒都小的能在宿主细胞内自主复制的病原体之一，它们不编码蛋白质，但会引起不同严重程度的症状，从轻微的影响，如几乎看不到的生长减缓，到变形、坏死或褪绿，以及受感染植物的严重发育不良。

番茄褪绿矮缩类病毒(Tomato chlorotic dwarfviroid，TCDVd)隶属于马铃薯纺锤形块茎类病毒科(Pospiviroidae)，马铃薯纺锤形块茎类病毒属(Pospiviroid)。主要寄主是碧冬茄属(Petunia)、番茄(Solanum lycopersicum)。TCDVd是近期各个贸易国家非常关注的茄科类病毒，美国、澳大利亚，泰国、俄罗斯、土耳其等国家通过SPS通报，要求进口到该国的茄科类种子必须进行生长季TCDVd监测，在出口前采用RT-PCR等方法检测TCDVd并出具未携带此类病毒的植物检疫证书。国外有要求对番茄(S.lycopersicum)、野生番茄(S.chilense)、克梅留斯基番茄(S.chmielewskii)、小花茄(S.peruvianum)及细叶番茄(S.pimpinellifolium)的TCDVd类病毒的强制性检测。TCDVd通过嫁接、芽接和刀具机械传播，远距离通过种子、种苗调运传播。而我国每年进口茄科种子的量非常大，病毒传入我国的风险很高，一旦定殖扩散，会对我国茄科作物生产造成严重损失。同时，我国也是茄科类种子全球主要的繁种基地之一，在出口过程中检测出TCDVd类病毒，则会被退货或销毁。

目前，该类病毒在我国的茄科植物上尚未被报道，目前国内尚未有专门针对该类病毒的检测专利和标准等相关报道。随着生物技术的快速发展和我国口岸快速通关的要求，迫切需要针对番茄褪绿矮缩类病毒的检测技术提出新的要求，满足口岸使用要求，从而保护我国农林业生产和生态安全。

通过对番茄褪绿矮缩类病毒检测技术的研究，规范番茄褪绿矮缩类病毒检测的各项技术指标和工作程序，设计建立番茄褪绿矮缩类病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测体系，实现对其快速、精确检测非常必要，这对番茄褪绿矮缩类病毒监测预警以及国门生物安全等方面具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种番茄褪绿矮缩类病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测引物、荧光探针、试剂盒及应用，采用的具体技术方案如下。

一种番茄褪绿矮缩类病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测荧光探针，序列为：5'-FAM-CGCCTTCCACAAGCTCCCTGCCGCCTTT-BHQ1-3'。

而且，与所述荧光探针配合使用的引物的核苷酸序列为：