[发明专利]番茄褪绿矮缩类病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测荧光探针、试剂盒及应用

权利要求书

1.一种番茄褪绿矮缩类病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测荧光探针，其特征在于序列为：5'-FAM-CGCCTTCCACAAGCTCCCTGCCGCCTTT-BHQ1-3'。

2.根据权利要求1所述的一种番茄褪绿矮缩类病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测荧光探针，其特征在于，与所述荧光探针配合使用的引物的核苷酸序列为：

正向引物：5'-GGGTTTTCACCCTTCCTTTC-3'；

反向引物：5'-TGTTTCWRCDGGGATTACTCCTG-3'。

3.一种番茄褪绿矮缩类病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：至少包括权利要求1所述的荧光探针和权利要求2所述的引物。

4.根据权利要求1～3中任一项所述番茄褪绿矮缩类病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测荧光探针、引物或试剂盒在检测番茄褪绿矮缩类病毒中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用为从马铃薯纺锤块茎类病毒、金鱼草潜隐类病毒、辣椒小果类病毒、番茄顶缩类病毒、番茄褪绿矮缩类病毒和番茄雄性株类病毒这6种马铃薯纺锤形块茎类病毒属中鉴别出番茄褪绿矮缩类病毒。

6.根据权利要求3所述的一种番茄褪绿矮缩类病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：还包括TaqMan实时荧光PCR扩增预混液和阳性质粒。

7.根据权利要求6所述的一种番茄褪绿矮缩类病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：阳性质粒是将SEQ ID NO.1所示序列插入pGEM-T载体中获得。

8.根据权利要求7所述的一种番茄褪绿矮缩类病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于用该试剂盒检测番茄褪绿矮缩类病毒的方法为：

步骤1.提取待测样品的RNA并逆转录为cDNA；

步骤2.实时荧光PCR体系为：TaqMan实时荧光PCR扩增预混液12.5μL，上下游引物(10μmol/mL)各1.0μL，TaqMan探针(10μmol/mL)0.5μL，cDNA模板3.0μL，用ddH₂O补充至总体积为25μL；实时荧光PCR反应条件为：50℃2min、95℃10min、95℃15s、60℃1min，40个循环；

步骤3.检测结果判定：Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，则结果为阳性；无Ct值或无扩增曲线，结果为阴性；Ct值35时，重做该样本，若重做结果无Ct值为阴性，否则为阳性。