[发明专利]报告核酸组合物及其制备方法和应用、检测试剂盒以及检测方法

说明书

本发明公开了一种报告核酸组合物及其制备方法和应用、检测试剂盒以及检测方法。报告核酸组合物，基于CRISPR技术，包括磁珠和报告核酸，所述报告核酸包括连接的单链核酸和酶，所述磁珠上连接有第一配体，所述单链核酸远离所述酶的一端连接有第二配体，所述第一配体和所述第二配体可以结合在一起。本发明的报告核酸组合物基于CRISPR技术，包括磁珠和报告核酸，所述报告核酸包括依次连接的单链核酸和酶，磁珠具有高比表面积、单分散性可控粒径等特点，磁珠上连接的单链核酸具有更大的空间伸展，不容易因为位置阻碍，导致切割位点被阻挡。相比于传统的采用电极的方案，磁珠表面可修饰更长的单链核酸来暴露更多切割位点。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种报告核酸组合物及其制备方法和应用、检测试剂盒以及检测方法。

背景技术

CRISPR技术，即CRISPR核酸检测技术，其可以用于植物、动物、微生物、病毒等来源的DNA或RNA分子的检测。CRISPR/Cas体系对核酸具有高选择性和特异性，可以检测到仅一个碱基的突变。

CRISPR/Cas系统由可轻松编程的引导RNA(crRNA)和Cas蛋白组成，可以根据crRNA与目标序列特异性互补来顺式切割靶标DNA或RNA。除了特异性结合和顺式切割靶标分子外，一些Cas蛋白(包括Cas12和Cas13等)的反式切割活性也被发现。即在Cas-crRNA复合物与靶标结合后激活反式切割活性，对附近非靶标的单链DNA或RNA进行无差异的切割。这种机制可以被用于裂解外源性引入的、自猝灭的荧光DNA或RNA报告体，并且具有极高周转率，从而实现信号放大。该现象被发现之后，基于CRISPR/Cas的新型诊断技术被广泛开发并用于核酸检测，

目前，基于CRISPR技术的核酸检测方法，通常在电极上结合带有高催化活性酶的核酸，Cas-crRNA复合物与待测靶标结合后置于电极表面，Cas-crRNA复合物激活反式切割活性后对单链核酸进行切割，一定时间后清洗并加入发光底物，一定时间后检测电极上的光信号，实现对待测靶标的检测。

然而，上述检测方法受限于电极的平面特性，连接在电极上的单链核酸彼此之间容易因为位置阻碍，导致切割位点被阻挡，特别是当电极上连接的单链核酸较长时，上述情况更容易发生。

发明内容

基于此，有必要提供一种可以解决上述问题的基于CRISPR技术的报告核酸组合物。

此外，还有必要提供一种上述报告核酸组合物的制备方法、上述报告核酸组合物在核酸检测领域的应用、包括该报告核酸组合物的检测试剂盒以及一种采用上述报告核酸组合物的检测方法。

一种报告核酸组合物，基于CRISPR技术，包括磁珠和报告核酸，所述报告核酸包括连接的单链核酸和酶，所述磁珠上连接有第一配体，所述单链核酸远离所述酶的一端连接有第二配体，所述第一配体和所述第二配体可以结合在一起。

在一个实施例中，所述第一配体为亲和素或链霉亲和素，所述第二配体为生物素。

在一个实施例中，所述单链核酸远离所述酶的一端为3’端，所述单链核酸的3’端连接有-(CH₂)_n，其中，n为4～20的自然数。

在一个实施例中，所述报告核酸的结构为：第二配体-三甘醇-单链核酸-(CH₂)_n-NH-COO-酶。

在一个实施例中，所述单链核酸的序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ IDNO.2所示。

一种上述的报告核酸组合物的制备方法，包括如下步骤：

提供磁珠、单链核酸和酶，所述磁珠上连接有第一配体，所述单链核酸的结构为：第二配体-三甘醇-单链核酸-(CH₂)_n-NH₂；