[发明专利]用于筛选大黄鱼DNA甲基化的分子标记的方法及qRT-PCR引物

权利要求书

1.用于筛选大黄鱼DNA甲基化的分子标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、从相同养殖条件下的养殖群体中，筛选生长性状具有显著差异的极大个体组和极小个体组；

步骤2、对极大个体组和极小个体组进行全基因组重亚硫酸盐测序，获得全基因组水平上的DNA甲基化遗传图谱，筛选得到两个群体的差异甲基化区域，从中获得具差异甲基化的生长轴功能基因；

步骤3、设计qRT-PCR引物，利用qRT-PCR技术检测具差异甲基化的生长轴功能基因的mRNA表达情况与甲基化的相关性，筛选差异甲基化功能基因；

步骤4、采用用于检测大黄鱼DNA甲基化的分子标记的引物，对差异甲基化功能基因进行单基因DNA甲基化水平与生长性状相关性的验证，获得对生长功能基因的表达水平具有显著调控作用的DNA甲基化位点，获得大黄鱼DNA甲基化的分子标记；

所述大黄鱼DNA甲基化的分子标记包括分子标记fgf11、分子标记fgfrs2、分子标记egflp7和分子标记pdgfrα；

所述分子标记fgf11的核苷酸序列为SEQ ID No.1；

所述分子标记fgfrs2的核苷酸序列为SEQ ID No.2；

所述分子标记egflp7的核苷酸序列为SEQ ID No.3；

所述分子标记pdgfrα的核苷酸序列为SEQ ID No.4；

所述用于检测大黄鱼DNA甲基化的分子标记的引物包括：

核苷酸序列为SEQ ID No.5的fgf11上游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.6的fgf11下游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.7的fgfrs2上游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.8的fgfrs2下游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.9的egflp7上游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.10的egflp7下游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.11的pdgfrα上游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.12的pdgfrα下游引物。

2.根据权利要求1所述的用于筛选大黄鱼DNA甲基化的分子标记的方法，其特征在于，所述步骤1中差异甲基化区域为甲基化C位点的差异甲基化区域，所述甲基化C位点的差异甲基化区域需具备如下特征：

至少在一个样品中该区域存在超过5个甲基化C碱基；

对于每个甲基化C位点的测序总深度的要求需在10以上，并且甲基化C位点的支持测序深度要在4以上；

该区域长度应处于40bp至10kb之间；

相邻两个甲基化C位点的距离不高于200bp；

存在2倍以上的平均甲基化水平；

卡方检验P≤0.05。

3.根据权利要求1所述的用于筛选大黄鱼DNA甲基化的分子标记的方法，其特征在于，所述步骤3中qRT-PCR引物包括：

核苷酸序列为SEQ ID No.13的fgf11上游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.14的fgf11下游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.15的fgfrs2上游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.16的fgfrs2下游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.17的egflp7上游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.18的egflp7下游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.19的pdgfrα上游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.20的pdgfrα下游引物。

4.用于筛选大黄鱼DNA甲基化的分子标记的qRT-PCR引物，其特征在于，包括：

核苷酸序列为SEQ ID No.13的fgf11上游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.14的fgf11下游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.15的fgfrs2上游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.16的fgfrs2下游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.17的egflp7上游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.18的egflp7下游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.19的pdgfrα上游引物；

核苷酸序列为SEQ ID No.20的pdgfrα下游引物；

所述大黄鱼DNA甲基化的分子标记包括分子标记fgf11、分子标记fgfrs2、分子标记egflp7和分子标记pdgfrα；

所述分子标记fgf11的核苷酸序列为SEQ ID No.1；

所述分子标记fgfrs2的核苷酸序列为SEQ ID No.2；

所述分子标记egflp7的核苷酸序列为SEQ ID No.3；

所述分子标记pdgfrα的核苷酸序列为SEQ ID No.4。