[发明专利]一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法

说明书

本发明涉及核酸检测领域，具体涉及一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法。本发明提供的一种等温核酸检测的酶组合物，所述酶组合物包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、重组酶辅助蛋白和Cas14a蛋白；利用所述酶组合物进行等温核酸检测时，无需对扩增产物进行单链化处理，实现对目的片段的一步法扩增及检测。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，具体涉及一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法。

背景技术

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是细菌和古细菌种抵御病毒入侵的一种获得性免疫的方式。当病毒入侵时，细菌或古细菌生成对应的能识别病毒基因组的向导RNA，可以引导具有核酸内切酶活性的Cas蛋白对病毒靶序列进行识别和切割。

CRISPR-Cas蛋白系统分为两大类，第一大类的Cas蛋白为多亚基组成的多蛋白效应复合物，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；第二大类的Cas蛋白为单效应蛋白，包括Ⅱ型的Cas9a、Ⅴ型的Cas12a和Cas14a，Ⅵ型的Cas13a。近年来，运用Cas12a和Cas13a蛋白的附带切割效应，CRISPR-Cas蛋白在核酸检测中有良好的应用，Cas12a蛋白擅长识别双链DNA，Cas13a蛋白擅长识别单链RNA，Cas14a蛋白擅长识别单链DNA，因而RNA、双链DNA和单链DNA都可以检测。Cas12a也可以检测单链DNA，但通过比较Cas12a蛋白和Cas14a蛋白检测单核苷酸多态性(SNP)的能力，发现Cas14a蛋白的特异性强可实现高保真的SNP基因分型。鉴于Cas14a蛋白优秀的高保真检测功能，如何利用Cas14蛋白来检测核酸越来越引起人们的关注。

在检测核酸时，由于核酸的数量比较少，通常需要先将核酸进行扩增，再对扩增产物进行检测，而Cas14a蛋白所检测的DNA为单链DNA，这就需要首先生成单链DNA，而一般的常用的PCR扩增方法产物都是双链DNA，这样要求在使用Cas14蛋白检测时，需要将双链DNA变成单链DNA再进行检测，而且由于扩增和检测需要分开进行，增加了操作的复杂性和污染的风险。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的Cas14蛋白检测核酸技术操作复杂、并且需要两步法检测的缺陷，从而提供一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法，将核酸扩增和Cas14蛋白检测相结合，在检测过程中，无需对扩增产物进行单链化处理，操作简单、反应速度快，将会极大的解决使用Cas14蛋白在核酸检测过程中的缺陷。

为此，本发明提供了如下的技术方案：

一种等温核酸检测的酶组合物，所述酶组合物包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、重组酶辅助蛋白和Cas14a蛋白。

可选的，所述的重组酶包括UvsX蛋白；可选的，所述UvsX蛋白包括T4 UvsX、T6UvsX或Rb69 UvsX；或

所述单链结合蛋白包括GP32蛋白；可选的，所述GP32蛋白包括T4GP32、T6 GP32或Rb69 GP32；或

所述DNA聚合酶包括链置换DNA聚合酶；可选的，所述链置换DNA聚合酶包括金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I的大片段、枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I大片段或大肠杆菌DNA聚合酶I大片段；或

所述重组酶辅助蛋白包括UvsY蛋白；可选的，所述UvsY蛋白包括T4 UvsY、T6 UvsY或Rb69 UvsY。

可选的，所述UvsX蛋白为如下A 1)-A 2)中任意一种：

A 1)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；

A 2)如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的蛋白；