[发明专利]用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物、试剂盒及鉴别方法

说明书

本发明属于白酒检测技术领域，公开了用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物、试剂盒及鉴别方法。用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物，为一对特异性ARMS引物：ARMS‑1F和ARMS‑1R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。本发明利用qPCR技术，建立了解淀粉芽孢杆菌的ARMS‑qPCR检测方法，实现区分大曲中解淀粉芽孢杆菌与其他近缘菌种，经特异性、检出限验证，表明利用本发明可快速、准确地进行鉴定，且相较于传统形态学、生理生化鉴定手段有误差大、效率低的缺点，该方法具体有操作简便、反应快速，能实现精准的定性鉴定。

技术领域

本发明属于白酒检测技术领域，具体涉及用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物、试剂盒及鉴别方法。

背景技术

四甲基吡嗪（Tetramethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪，属生物碱类，是一种含氮杂环化合物，广泛存在于食品原料、咖啡以及乳制品中，具有烘烤香气、甜香，是中国白酒中的重要香气化合物之一。近年来，很多文献报道了大曲中高产四甲基吡嗪菌株的筛选情况，常见的高产四甲基吡嗪的菌株有地衣芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、蛋白水解芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌等。

芽孢杆菌是大曲中高产四甲基吡嗪的主要菌株。枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌等是近缘种。区分解淀粉芽孢杆菌与其他菌株，可以判断高产四甲基吡嗪的菌株在大曲中的生长情况。

传统的大曲中解淀粉芽孢杆菌的区分方法是微生物涂布平板法，需要提取大曲样品进行稀释涂布，待平板长出菌落通过形态学观察来判断种类，同时以生理生化实验辅助来辨别菌种，但芽孢杆菌近缘种在形态上难以区分，且生理生化实验复杂繁琐，导致该方法误差大且耗时。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为解决背景技术中的问题，本发明的第一目的在于提供用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物，该引物可以鉴别出大曲中解淀粉芽孢杆菌与其他近缘菌种。

本发明的第二目的在于提供用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的试剂盒。

本发明的第三目的在于提供用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的方法。能够快速、准确地鉴别出解淀粉芽孢杆菌与其他近缘菌种。

为达到上述目的，本发明采用的第一个技术方案为：

用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物，为一对特异性ARMS引物：ARMS-1F和ARMS-1R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。

优选的，所述ARMS引物是使用PCR引物2-F和2-R扩增解淀粉芽孢杆菌后设计得到，所述2-F和2-R的碱基序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。

本发明采用的第二个技术方案为：

用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的试剂盒，包含第一个技术方案的用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物。

本发明采用的第三个技术方案为：

用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的方法，包含以下步骤：

提取待测菌株基因组DNA；

以待检测菌株基因组DNA为模板，利用权利要求1或2所述的用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物进行实时荧光定量PCR方法进行定量分析，根据扩增循环数差值鉴别出大曲中解淀粉芽孢杆菌。

优选的，所述实时荧光定量PCR方法反应程序为：95℃预变性10 min；95℃变性10s，60℃退火30 s，75℃延伸45s，40个循环，在60℃收集荧光信号。