[发明专利]一种独特基因缺失组合的PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株及其应用

说明书

本发明属于基因工程技术和病毒学技术领域，具体涉及一种独特基因缺失组合的PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株及其应用。该四基因缺失株是通过缺失伪狂犬病病毒的gE基因、TK基因、UL56基因和US3基因后得到的，具体是先制备PRVΔgE/TK/UL56三基因缺失株，然后通过同源重组技术、Cre‑LoxP系统，在PRVΔgE/TK/UL56三基因缺失株的基础上缺失毒力基因US3，获得PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株。本发明的四基因缺失毒株可作为弱毒活疫苗，免疫仔猪后未出现PRV临床症状，具有良好的安全性，且能够对PRV强毒的攻击提供完全保护。

技术领域

本发明属于基因工程技术和病毒学技术领域，具体涉及采用同源重组技术、Cre-LoxP系统构建PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株，还涉及该基因缺失毒株在防控猪伪狂犬病中作为疫苗的应用。

背景技术

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)属于疱疹病毒科(Herpesviridae)α疱疹病毒亚科(Alpha Herpesririnae)。猪是其自然宿主，可引起妊娠母猪流产、种猪不育、新生仔猪腹泻和神经系统症状。机体耐过PRV急性感染后，其病毒颗粒可在宿主三叉神经节建立长期潜伏感染而终身带毒。当受到外界应激或刺激时，体内潜伏的病毒粒子可重新被激活，造成复发性感染。该病目前尚无有效的药物可以进行治疗，疫苗免疫接种仍是预防和控制该病发生和流行的主要措施。随着PRV基因缺失疫苗(Bartha-K61)的引入接种使用加上科学严格的规模化养殖，使得该病在一定程度上得以控制。

PRV基因组是双链线性DNA，约143kb，含有70个开放阅读框，具有很强的遗传稳定性。GC含量高达70％以上，是疱疹病毒中GC含量最高的。基因组由一个长的独特区域(UL)、一个短的独特区域(US)及位于US两侧的内部重复序列(IRS)、末端重复序列(TRL)组成。病毒基因组至少包括70个基因，可以编码70至100种病毒蛋白，其中多数基因是病毒复制非必需的。病毒增殖必需的糖蛋白主要有gL、gD、gB、gK、gH；非必需糖蛋白主要包括gG、gE、gC、gI、gM和gN等。PRV毒力受多个基因编码蛋白的影响，如gE、gC、gI、gD、gB、gH、TK、PK及RR等，缺失这些基因可以显著降低PRV毒力。

随着分子生物学的发展，对PRV基因组研究不断的深入，更进一步了解基因组结构对病毒生物学性质和免疫原性的影响，第二代弱毒活疫苗--基因缺失疫苗应运而生。猪伪狂犬基因缺失疫苗其优势主要表现在：基因缺失疫苗稳定，不易发生毒力返祖增强；PRV基因缺失株毒力低，免疫原性强，保护时间长；可用于疫苗免疫动物与自然感染动物的鉴别诊断。

公开号为CN 110699329 A的中国发明专利申请，公开了基因缺失的减毒伪狂犬病病毒，其是通过基因工程手段将原始毒株的Us3基因序列，以及任选的包含Us区域的其他基因、gE、gI、和/或TK基因缺失以制备基因缺失减毒伪狂犬病病毒。该专利申请并未涉及UL56基因的缺失。

发明内容

本发明通过缺失伪狂犬病病毒的gE、TK、UL56和US3基因，制备了一种免疫效力更强、安全性更高的新型基因缺失疫苗株PRVΔgE/TK/UL56/US3，进而有效防控和根除伪狂犬病。

本发明的猪伪狂犬病病毒基因缺失株，是通过缺失伪狂犬病病毒的gE基因、TK基因、UL56基因和US3基因后得到的PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株。

具体的，本发明的PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株，是先制备PRVΔgE/TK/UL56三基因缺失株，然后通过同源重组技术、Cre-LoxP系统，在PRVΔgE/TK/UL56三基因缺失株的基础上缺失毒力基因US3，获得PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株，其制备方法具体包括以下步骤：

(1)PRVΔgE/TK/UL56三基因缺失株的构建：