[发明专利]灵长类动物DNA甲基化相对定量试剂盒

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种灵长类动物DNA甲基化相对定量试剂盒。该试剂盒包括：a）幼斑马鱼DNA或不含CpG位点的斑马鱼DNA，以及b）DNA定量检测试剂，其至少包含用于定量检测a）的试剂；所述幼斑马鱼为自受精卵形成至发育120小时以内的斑马鱼。该试剂盒能够实施实现灵长类动物DNA甲基化的准确定量，避免了内源内参容易受到自身因素或收样原因导致的不稳定或基因组DNA污染的问题。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种灵长类动物DNA甲基化相对定量试剂盒。

背景技术

现在对于特定基因或特定DNA序列甲基化水平的研究，大多基于亚硫酸氢盐转化方法。亚硫酸氢盐转化后可通过测序法、PCR法、数字PCR法、限制酶消化法、芯片等方法检测甲基化水平。在实际临床应用和检测试剂盒开发中，采用最多的方法是PCR方法。

PCR方法用于甲基化定量研究，起始DNA量较多的情况（如：组织来源DNA或脱落细胞DNA等）通常使用绝对定量方法；微量DNA（如血浆游离ctDNA等），有研究使用预扩增方法，预扩增PCR的循环数通常为30个循环以上：预扩增产物稀释后，使用绝对定量方法定量。但微量DNA甲基化定量检测，使用最多的是相对定量方法，利用靶标与ACTB的CP值，根据公式：2^-ΔΔCT=2-[CT（靶标，样本）-CT（内参，样本）]-[ CT（靶标，阳性对照）-CT（内参，阳性对照）]进行相对定量值的计算。

对于微量DNA（如血浆游离ctDNA等）甲基化定量检测，如果使用预扩方法，在实际应用中，过程繁琐，需两步PCR，且第一次PCR产物需开盖稀释，由于循环数通常在30个循环以上，开盖容易造成污染；如果使用相对定量方法，现在研究方法，使用ACTB作为内参，ACTB的水平容易受到外源或内源的影响，会影响到靶标的实际定量。

以血浆样本为例说明，外源影响例如：1）使用普通EDTA管采血，血浆样本未按照规定进行血浆分离，2）使用cfDNA保存管，未按照温度范围进行全血邮寄（气温过高或过低时需要加冰袋和暖宝宝运输）、未按规定进行血浆分离。内源影响：受试者有炎症、自身免疫疾病等疾病，体内白细胞数量，白细胞破裂升高现象，导致体内游离DNA水平升高。外源和内源影响产生的后果：细胞破裂，游离DNA的含量升高，检测CP值降低，当计算靶标基因甲基化相对于ACTB的含量时，其相对含量会降低。这种降低并非是肿瘤来源的异常甲基化DNA降低，而是由于背景增加导致的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明采用投入外源内参，进行靶基因甲基化水平的相对定量检测。

本发明第一方面涉及一种灵长类动物DNA甲基化相对定量试剂盒，包括：

a）幼斑马DNA或不含CpG位点的斑马鱼DNA，以及

b）DNA定量检测试剂，其至少包含用于定量检测a）的试剂；

所述幼斑马鱼为自受精卵形成至发育120小时以内的斑马鱼。

本发明第二方面涉及一种用于甲基化测定的灵长类动物DNA预处理方法，包括：

a）将幼斑马鱼DNA或不含CpG位点的斑马鱼DNA与待检测的灵长类动物靶核酸混合；所述幼斑马鱼为自受精卵形成至发育120小时以内的斑马鱼；

b）将幼斑马鱼DNA或不含CpG位点的斑马鱼DNA、灵长类动物靶核酸进行亚硫酸盐定序；

c）任选的纯化DNA；

其中，a）、b）无先后顺序。

本发明的有益效果为：