[发明专利]黑木耳凝集素的提取方法

说明书

黑木耳凝集素的提取方法，它涉及一种黑木耳凝集素的提取方法。本发明是为了提供一种黑木耳凝集素的提取方法。本方法：一、制备黑木耳凝集素粗提液3MTHS1‑0；二、制备上清液3MTHS1‑1；三、解离；四、制备溶液3MTHS1‑2；五、制备提取液1；六、制备提取液2；七、将提取液1、提取液2和溶液3MTHS1‑2合并，进行5kDa超滤除盐，凝缩至2mL，再用10kDa的超滤离心管以4400r/min继续超滤至0.5mL，超滤过程中加水除盐3次，冷冻干燥，即得黑木耳凝集素。本发明提取的黑木耳凝集素对RAW264.7细胞无细胞毒性，而且可以提高RAW264.7细胞的增殖活性、核酸代谢活性和吞噬能力。具有免疫调节活性。本发明属于凝集素的提取领域。

技术领域

本发明涉及一种黑木耳凝集素的提取方法。

背景技术

黑木耳是常见的食用菌,不仅营养丰富,还具有众多的生物活性。近年来对黑木耳多糖研究较多,对于其他成分研究较少，凝集素(Lectin)是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球(含血型物质)，故名凝集素。常用的为植物凝集素(Phytoagglutin，PNA)，通常以其被提取的植物命名。凝集素是动物细胞和植物细胞都能够合成和分泌的、能与糖结合的蛋白质，在细胞识别和粘着反应中起重要作用，主要是促进细胞间的粘着。凝集素具有一个以上同糖结合的位点，因此能够参与细胞的识别和粘着，将不同的细胞联系起来。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种黑木耳凝集素的提取方法。

黑木耳凝集素的提取方法按照以下步骤进行：

一、称取干燥的黑木耳5g，加入100m L的磷酸盐缓冲液，在捣碎机中充分搅碎至粘稠的匀浆，每5min搅碎2次，两次之间将黑木耳匀浆放入冰浴中制冷3min，将黑木耳匀浆以5000r/min冷冻离心30min，收集上清液后采用四层FN 15膜高压过滤，滤液为黑木耳凝集素粗提液3MTHS1-0；

二、将25mL 3MTHS1-0与25mL猪胃粘蛋白II型-溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B充分混合，于6℃搅拌过夜，次日以3000r/min离心5min，得到上清液3MTHS1-1；

三、将步骤二离心后的下层液分别用10mL PBS缓冲液洗三次，以3000r/min离心速率离心5min，弃去上清液；

四、解离：向步骤三所得的溶液中加入10mL甘氨酸浓度为0.1mol/L、NaCl浓度为1mol/L、pH值为3.0的溶液，充分摇匀10min，以3000r/min离心速率离心5min，在得到的上清中加入Tris-HCl缓冲溶液；

五、重复步骤四三次，并将三次得到的溶液合并，得到溶液3MTHS1-2；

六、向步骤四中弃去上清液后的溶液中加入2ml浓度为1mol/L、pH值为7.8的Tris-HCl缓冲溶液和25mL PBS缓冲溶液，以3000r/min离心5min，清洗2次；

七、将3MTHS1-1按照步骤二-步骤五的步骤重复提取，得到提取液1；

八、将3MTHS1-0按照步骤二-步骤五的步骤重复提取，得到提取液2；

九、将提取液1、提取液2和溶液3MTHS1-2合并，进行5kDa超滤除盐，凝缩至2mL，再用10kDa的超滤离心管以4400r/min继续超滤至0.5mL，超滤过程中加水除盐3次，冷冻干燥，即得黑木耳凝集素。

步骤一中所述磷酸盐缓冲液浓度为10mmol/L、pH值为7.6。

步骤四中按照每10mL上清中加入1mL Tris-HCl缓冲溶液的比例加入Tris-HCl缓冲溶液。

步骤四中所述Tris-HCl缓冲溶液浓度为1mol/L、pH值为7.8。