[发明专利]薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法

说明书

本发明提供了一种薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，涉及分子标记技术领域。本发明薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，首先将薄壳山核桃基因组DNA双酶切得到酶切产物，将得到的酶切产物与接头引物进行连接，得到连接产物；随后将连接产物进行预扩增得到预扩增产物，并将预扩增产物进行选择扩增；最后对选择扩增的产物进行凝胶电泳及银染显色。通过上述方法建立一套客观、科学、准确的薄壳山核桃DNA甲基化分析技术体系，可以获得银染背景低、目的条带清晰的DNA甲基化图谱，具有可在未知基因组序列的情况下对全基因组甲基化开展研究且甲基化位点易于检测的优点。

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，尤其是涉及一种薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法。

背景技术

薄壳山核桃(Carya illinoensis Koch)，又名美国山核桃或长山核桃，俗称“碧根果”，是胡桃科山核桃属植物，原产美国和墨西哥北部，是世界上著名的干果树种之一。薄壳山核桃其坚果个大、壳薄，出仁率高，取仁容易，产量高，同时果仁色美味香、无涩味、营养丰富，是理想的保健食品或面包、糖果等食品的添加材料。此外，薄壳山核桃亦是重要的木本油料植物，种仁油脂含量高在70％以上，其中不饱和脂肪酸含量高达97％，有很好的贮藏性，是上等的烹调用油和色拉油。薄壳山核桃在我国引种栽培已具有100多年的历史，由于长期存在的不科学的育种及种植方法，我国薄壳山核桃产业存在优良品种缺乏、扩繁技术落后、配套管理技术不完善等问题。因此，对薄壳山核桃的研究越来越得到国家和农林科技人员的重视。

目前在薄壳山核桃遗传育种改良方面已经开展了同属不同种间的杂交育种、选择育种和分子标记辅助育种等工作，其中将传统的杂交育种技术同不断发展的生物技术结合来获得优良性状是遗传改良的工作重点。目前虽然已在薄壳山核桃遗传育种改良方面开展了相关工作，但是从DNA甲基化这一表观遗传调控层面出发并应用于分子标记辅助育种方面的研究尚未见报道。

DNA甲基化是最早发现的表观遗传修饰途径之一，能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，进而影响基因表达，是大多数生物体生长发育过程中不可缺少的一部分。甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitiveamplification polymorphism，MSAP)技术是一种对基因组DNA甲基化进行分析的相对简单且较常用的方法。根据Hpa II及Msp I这两种酶对基因组中“5’-CCGG-3’”位点中胞嘧啶甲基化状态不同而具有不同的酶切活性，可以酶切产生多态性的DNA片段并最终通过比较PCR扩增产物电泳图谱来分析DNA甲基化状况。

因此，建立一套科学准确的薄壳山核桃DNA甲基化分析技术体系，进而在未知基因组序列的情况下对薄壳山核桃全基因组甲基化开展研究，变得十分必要和迫切。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，所述薄壳山核桃MSAP技术体系建立后可以在未知基因组序列的情况下对薄壳山核桃全基因组甲基化开展研究，通过遗传学分子标记的方法，对研究、培育抗病抗逆性强的新薄壳山核桃品种具有非常现实的意义。

本发明提供的一种薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，所述方法包括以下步骤：

首先将薄壳山核桃基因组DNA双酶切得到酶切产物，将得到的酶切产物与接头引物进行连接，得到连接产物；随后将连接产物进行预扩增得到预扩增产物，并将预扩增产物进行选择扩增；最后对选择扩增的产物进行凝胶电泳及银染显色。

进一步的，所述将薄壳山核桃基因组DNA双酶切的酶切体系为：400ng DNA、0.3μLEcoR I-HF、0.3μL Msp I或0.3μL HpaⅡ、2μL Cut sm art Buffer、无菌水补足至20μL。

更进一步的，所述酶切分为4～6个时间梯度，每一时间梯度酶切结束后放入65～70℃温浴20min；