[发明专利]薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法

权利要求书

1.一种薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

首先将薄壳山核桃基因组DNA进行双酶切，将得到的酶切产物与接头引物进行连接，得到连接产物；随后将连接产物进行预扩增得到预扩增产物，并将预扩增产物进行选择扩增；最后对选择扩增的产物进行凝胶电泳及银染显色。

2.根据权利要求1所述的薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，其特征在于，所述将薄壳山核桃基因组DNA双酶切的酶切体系为：400ng DNA、0.3μL EcoR I-HF、0.3μL Msp I或0.3μL HpaⅡ、2μL Cut smart Buffer、无菌水补足至20μL。

3.根据权利要求2所述的薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，其特征在于，所述酶切分为4～6个时间梯度，每一时间梯度酶切结束后放入65～70℃温浴20min；

优选的，所述酶切的温度为35～37℃，所述酶切的时间为5h。

4.根据权利要求1所述的薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，其特征在于，所述酶切产物与接头引物进行连接的反应体系为：酶切产物20μL、0.1μl T4 DNA ligase、2.5μlATP、E adaptor和H/M adaptor均为0.5μL，无菌水补足至25μL；

优选的，所述E-adaptor接头引物，其上游引物为：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’，下游引物为：5’-AATTGGTACGCAGTCTAC-3’；

所述H/M adaptor接头引物，其上游引物为：5’-GACGATGAGTCTAGAA-3’，下游引物为：5’-CGTTCTAGACTCATC-3’。

5.根据权利要求1所述的薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，其特征在于，所述预扩增反应体系为：0.5～2.5μl连接产物、0.1～0.3μl Ex Taq酶、1～3μl dNTP、预扩增引物pre-E和pre-H/M各0.5～2.5μL，2.5μl 10×Ex Taq Buffer，无菌水补足至25μl。

6.根据权利要求5所述的薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，其特征在于，其中：

所述预扩增引物pre-E为：5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’，

预扩增引物pre-H/M为：5’-GATGAGTCTAGAACGGT-3’。

7.根据权利要求1所述的薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，其特征在于，所述选择扩增反应体系为：稀释0～200倍的预扩增产物0.5～2.5μl、Ex Taq酶0.1～0.3μl、0.5～2.5μl dNTP、选择扩增引物En0.3～2μl、选择扩增引物HMn0.3～2μl、2.5μl 10×Ex TaqBuffer，无菌水补足至25μl。

8.根据权利要求7所述的薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，其特征在于，其中：

所述选择扩增引物En序列为：5’-GACTGCGTACCAATTCAXX-3’，

所述选择扩增引物HMn序列为：5’-GATGAGTCTAGAACGGTXX-3’，

所述引物序列中X代表A，T，C，G四种碱基中的任意一种。

9.根据权利要求1所述的薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，其特征在于，所述方法还包括对引物进行筛选的步骤。

10.根据权利要求1～9任一项所述的薄壳山核桃MSAP技术体系的建立方法，其特征在于，所述薄壳山核桃的品种为‘波尼’和‘绍兴’。