[发明专利]用于检测人类EGFR基因T790M突变的引物、检测方法及试剂盒

说明书

本发明提供了用于检测人类EGFR基因T790M突变的引物、检测方法及试剂盒。本发明提供的检测引物能与EGFR基因保守序列结合，扩增突变序列。本发明提供的检测方法采用检测荧光信号基团能与扩增片段结合发出荧光信号，利用阻断剂与突变位点对应的野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异性扩增。本发明采用竞争性等位基因特异性PCR扩增技术，建立基于实时荧光PCR的试剂盒，可准确检测EGFR基因T790M突变。本发明方法操作简单，结果易读，灵敏度高，能检出含0.001％EGFR基因T790M突变的样本，实现对EGFR基因T790M突变的超灵敏检测。

本申请要求了2017年10月13日提交中国专利局的，申请号为201710955204.4，发明名称为“用于超灵敏检测人类EGFR基因突变的引物、检测方法及试剂盒”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测人类EGFR基因T790M突变的引物、检测方法及试剂盒。

背景技术

人类表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种蛋白酪氨酸激酶受体，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，具有酪氨酸激酶活性。它是HER/ErbB家族成员之一，因此又名HER1或ErbB1。EGFR与其配体结合后在细胞表面形成二聚体，通过酪氨酸激酶的活性，激活受体自磷酸化，在细胞内发出信号，经过细胞质中衔接蛋白和酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。当EGFR发生突变时，EGFR自身或其配体过表达，从而通过自分泌或旁分泌方式刺激细胞形成失控性增殖。此外，EGFR过度活化还可以启动多种蛋白水解酶和促血管生成因子的表达，从而加速癌细胞的转移。因此，EGFR过表达者通常预后较差。

美国食品药品监督管理局于2003年5月批准了美国阿斯利康(Aotrazeneca)公司生产的小分子基因靶点药物吉非替尼(Gefitinib，也称为易瑞沙/Iressa)用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)，我国也与2005年2月批准了吉非替尼进入临床。吉非替尼是一种口服的小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，它可以特异性地竞争结合癌细胞EGFR激酶功能区的ATP结合位点，通过抑制该酶的活性来抑制肿瘤的增长、增殖，却无明显的化疗副作用。美国哈佛医学院的研究人员Lynch等率先报道，肺癌细胞中有EGFR酪氨酸激酶基因编码区18～21外显子突变的患者，靶向药物吉非替尼的有效率高达80％以上。这种现象可能是由于EGFR突变使EGFR酪氨酸激酶ATP结合位点的某些基团发生重构，增强了与ATP 或其竞争性抑制剂吉非替尼的相互作用。因此，有EGFR基因突变的患者表现出对吉非替尼更好的治疗反应。研究表明，美国非小细胞肺癌患者中只有约10％有EGFR基因突变，然而在亚洲人中，约30％的非小细胞肺癌患者有EGFR基因突变。临床运用的结果表明，EGFR 基因外显子18～21的突变(体细胞突变)是患者对此类靶向药物有效的必要前提，如果病人不携带有EGFR基因突变而服用此类药物，不仅耽误病情还造成巨额药费的浪费。因此，在用药前筛查检测病人是否携带有EGFR基因突变显得尤为重要，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。

目前，针对EGFR基因突变的检测方法主要有直接测序法、传统的荧光定量PCR法和高分辨率熔解曲线法。测序法耗时长且灵敏度低，通常只用于科研，难以用于临床的检测。传统的荧光定量PCR法难以使突变型基因在大量的野生型基因中得到专一性的扩增，容易产生假阳性的检测结果。高分辨率熔解曲线法所使用的仪器较特殊，难以在医院进行普及，而且此方法在检测缺失突变时，效果较差。

若能在癌症早期检测出癌基因，早发现早治疗，另外，快速准确灵敏地检测这些与药物反应性有关的基因突变，可以大大提高癌症患者的存活率。但由于癌症早期癌变样品特别是血液样品中的癌基因含量很少，而以上方法的检测灵敏度最多只能达到0.2％，远远还没达到从大量正常DNA背景下检测极其微量的异常DNA分子的要求，因此，快速准确灵敏地检测这些与药物反应性有关的EGFR基因突变，就成为人们亟待解决的问题。