[发明专利]一种茎环结构组合探针及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种具有茎环结构的组合探针，以及该组合探针在端粒酶活性检测及RNA和DNA定量检测中的应用。

背景技术

端粒酶(Telomerase)是一种使端粒延伸的反转录DNA合成酶，是由RNA和蛋白质组成的核糖核酸-蛋白质复合物。端粒酶弥补了因每次细胞分裂而逐渐缩短的端粒长度。但是端粒酶的活性在正常体细胞中受到相当严密的调控，所以端粒酶活性在正常的人体细胞中受到抑制，但在肿瘤细胞中被激活，与癌细胞的不断增殖密切相关。所以检测端粒酶的活性，可以实现对癌症的诊断，同时以端粒酶为靶标分子，研究有效的端粒酶活性抑制剂，对开发抗癌药物具有重要意义。传统的检测端粒酶的方法主要是基于PCR扩增技术的端粒重复放大的方法(Telomeric Repeat Amplification protocol，TRAP)。该方法在经过PCR扩增后进行电泳分离和检测，可以检测到几个癌细胞中端粒酶的活性，但是操作比较繁琐，而且电泳分析不能达到定量分析的结果。更为重要的是在筛选端粒酶活性抑制剂实验过程中，这些抑制剂也可能抑制PCR扩增反应中DNA聚合酶的活性，所以TRAP方法不适于端粒酶抑制剂的筛选检测。随后发展起来的端粒酶检测方法是放射性同位素标记后的成像分析，该方法存在放射性污染，对人体和环境有一定的危害，由此大大增加了操作的复杂性，限制了该方法的应用。所以人们一直在努力研究建立端粒酶活性检测方法。如表面等离子体共振、电化学分析、量子点荧光共振能量转移、端粒酶诱导生成金属纳米线、具有催化性能的分子信标、PPI生物发光等。但是这些方法由于缺乏有效的DNA扩增信号放大过程，导致这些方法的灵敏度都达不到TRAP的水平。因此，考虑到抗癌药物筛选工作量大以及检测成本等各方面的需要，理想的端粒酶活性检测方法应摆脱放射性污染的缺点，且需满足检测快速、操作简便、选择性好、灵敏度高、可靠、普适、经济等特点。

RNA和DNA是生命体重要的遗传物质，RNA和DNA的表达水平与癌症发展密切相关，可以作为癌症早期诊断的标志物，对特定序列RNA和DNA进行准确、灵敏检测对于RNA和DNA生物功能的研究和癌症早期诊断都具有十分重要的意义。RNA和DNA的分析方法主要为杂交反应的检测方法。其中Southern印迹杂交方法需要经过电泳分离，结合放射性同位素标记或酶标记利用放射自显影或酶反应显色实现RNA和DNA的定量分析。该方法存在放射性危害，对人体造成伤害，且检测信号无法实时监测等弊端，需要复杂的操作步骤才能实现信号的读出。分子信标(Molecular Beacon，简称MB)探针技术以发夹结构存在，其茎部双链两端分别标记荧光基团和猝灭基团，无目标RNA或DNA存在时，MB以发夹结构存在，荧光猝灭。目标RNA或DNA存在时会与MB杂交产生目标RNA或DNA的特异性荧光信号，该分子信标检测方法已经获得了广泛应用。但需要指出的是该方法缺乏信号放大机制，使得检测灵敏度受到了很大的限制，并且分子信标需要双标记，价格昂贵。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有端粒酶活性检测及RNA和DNA定量检测存在的问题，提供一种成本低廉、灵敏度高、选择性好的茎环结构组合探针，以及该组合探针在端粒酶活性检测及RNA和DNA定量检测中的应用。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：该组合探针由两个具有茎环结构的DNA序列组成，其中探针I和探针II从5′端到3′端依次为茎环区、检测物识别区，所述的检测物为端粒酶、RNA或DNA，探针I和探针II的茎环区的碱基序列相同或不同，其中当检测物为端粒酶时，所述探针I的检测物识别区是端粒酶底物序列，探针II的检测物识别区是与端粒酶延伸序列中8～40个碱基互补的序列；当检测物为RNA或DNA时，所述探针I的检测物识别区是与待测RNA或DNA的邻近3′端8～40个碱基互补的序列，探针II的检测物识别区是与待测RNA或DNA的邻近5′端8～40个碱基相同的序列。

上述的茎环区的茎的长度优选为5～18个配对的碱基序列，茎环区的环的长度优选为15～35个碱基序列。

上述的检测物为端粒酶时，探针I的检测物识别区是端粒酶底物序列，优选探针II的检测物识别区是与端粒酶延伸序列中15～25个碱基互补的序列。

上述的检测物为RNA或DNA时，优选探针I的检测物识别区是与待测RNA或DNA的邻近3′端15～25个碱基互补的序列，优选探针II的检测物识别区是与待测RNA或DNA的邻近5′端15～25个碱基相同的序列。