[发明专利]测序基因分型技术中测序酶切组合的确定方法

说明书

本发明提供了一种测序基因分型技术中测序酶切组合的确定方法，包括以下步骤：(1)对目的基因组进行限制性内切酶酶切位点预测，统计不同酶切方式获得的酶切片段数目；(2)根据步骤(1)中所预测的各种酶切方式的酶切片段设计每种酶切片段两端的接头序列及PCR扩增引物序列；(3)分别针对不同酶切方式利用GBS技术构建测序文库；(4)利用步骤(3)构建的测序文库进行测序；(5)根据测序结果获得SNP标记位点；(6)根据不同酶切组合所获得的SNP标记位点个数、酶切片段大小确定针对目的基因组的特定酶切组合。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种测序基因分型技术中测序酶切组合的确定方法。

背景技术

遗传分子标记(在一个或多个群体内不同个体间可测量的可遗传多态性)牢牢地占据着现代遗传学的核心地位，也是群体遗传学，生态学和发育生物学等学科的重要研究方向。目前主流的遗传标记已经发展至第三代，即单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphisms，SNP)分子标记。这种遗传标记的特点是单个碱基的置换，并且一般只有两种碱基组成，是一种二态的标记，与第一代的RFLP及第二代的STR以长度的差异作为遗传标记的特点截然不同。

目前主流的全基因组SNP分型技术主要有基因分型芯片和二代测序两种方法。基因分型芯片的特点是技术稳定，结果重复率高，但芯片技术分型一个实验样本的成本很高，对于群体遗传学研究领域，群体分型的成本代价太大，并且芯片技术由于技术所限，还存在着SNP多态位点在不同群体中通用差，标记密度低(目前农业动物领域主流的SNP芯片密度约为60000个SNP/芯片)等缺陷，不能满足精细功能基因定位和全基因组关联分析等问题。下一代测序技术的发展使得基因组学和转录组学的研究能够更加深入，测序能获得全基因组水平的高密度标记图谱，但同时也存在着单位样本成本过高的缺点。

简化基因组测序技术(reduced-representation sequencing)使得群体分析研究所需的覆盖全基因组的高通量分子标记的鉴定与分型成为可能。但不同的简化基因组测序方法在建库策略、单酶切/双酶切的组合选择、测序平台的选择等方面均有较大差别，这些都会显著影响后续分型的效率和成本。举例来说，RAD测序的方法，建库策略复杂，过多的步骤会干扰后续实验结果；不同的限制性内切酶在不同的物种基因组上酶切频率和分布均有较大不同，对于特定物种，选用哪种酶进行实验就成为决定实验获取SNP数量和成本的决定因素；2b-RAD技术使用ⅡB型限制性内切酶，2b-RAD技术虽然可以得到全基因组水平的酶切片段，但这种酶切的片段大小只有25-35bp，根据全基因组变异的平均频率，过短的酶切片段很难富含SNP位点，会带来大量的测序数据损失；此外，短序列在面对基因组重复区域比对的时候，会带来大量的比对错误，也会强烈干扰到SNP的分型准确性，进而严重干扰下游应用。当进行SNP标记位点分析时，单酶切不利于后续试验中酶切片段的筛选，而部分双酶切组合存在着酶切片段过多或过少的缺点，酶切片段过多会增加实验成本，酶切片段过少将降低SNP挖掘的密度，进而影响后续生物学分析，还有的酶切组合会由于基因组的甲基化影响酶切效率。综上诸多原因，对任何需要研究的物种，酶切组合优选的实验是必不可少的。

因此有必要开发一种新的具有各物种通用的SNP标记位点分析过程中酶切组合的确定方法，从而在进行SNP标记位点分析时快速简便的获得最适的酶切组合，以降低基因分型的成本，为基因分型后的下游应用提供便利。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于测序基因分型技术的SNP标记位点分析过程中酶切组合的确定方法。

为达到以上目的，本发明提供了一种测序基因分型技术中测序酶切组合的确定方法，包括以下步骤：

(1)对目的基因组进行限制性内切酶酶切位点预测，统计不同酶切方式获得的酶切片段数目；

(2)根据步骤(1)中所预测的各种酶切方式的酶切片段设计每种酶切片段两端的接头序列及PCR扩增引物序列；