[发明专利]测序基因分型技术中测序酶切组合的确定方法

权利要求书

1.一种基于测序基因分型技术的重要农业经济动物SNP标记位点的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对目的基因组进行限制性内切酶酶切位点预测，统计不同酶切方式获得的酶切片段数目；

(2)根据步骤(1)中所预测的各种酶切方式的酶切片段设计每种酶切片段两端的接头序列及PCR引物序列；

(3)分别针对不同酶切方式利用GBS技术构建测序文库；

(4)利用步骤(3)构建的测序文库进行测序；

(5)根据测序结果获得SNP标记位点；

(6)根据不同酶切组合所获得的SNP标记位点个数、酶切片段大小确定针对目的基因组的特定酶切组合EcoR I-Msp I；

其中，在步骤(1)中，对目的基因组的酶切位点预测为双酶切预测；

所述重要农业经济动物为牛或羊；

步骤(1)中所述的酶切方式包括如表1所示的8种双酶组合方式；

表1

步骤(2)中每种酶切片段的接头序列包括通用接头和条形码接头；其中，所述通用接头由通用接头序列1和通用接头序列2退火形成，所述条形码接头由条形码接头序列1和条形码接头序列2退火形成；

所述通用接头序列，条形码接头序列及PCR引物序列如下表3所示：

表3

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤(3)中包括以下步骤：

(a)利用限制性内切酶对基因组进行酶切获得酶切产物；

(b)制备通用接头和条形码接头；

(c)将通用接头和条形码接头按一定比例混合以形成接头混合物，然后将其与酶切产物进行连接反应，获得连接产物；

(d)将连接产物等比例进行混池，获得混池后的连接产物；

(e)在混池后的连接产物中加入1.2-1.4倍体积的磁珠进行第一纯化获得第一纯化产物；

(f)在所述第一纯化产物中加入0.8-0.9倍体积的磁珠进行第二纯化获得第二纯化产物；

(g)对第二纯化产物进行PCR扩增获得PCR产物；

(h)在PCR产物中加入1.2-1.4倍体积的磁珠进行第三纯化获得第三纯化产物；

(i)在第三纯化产物中加入0.8-0.9倍体积的磁珠进行第四纯化获得简化基因组测序文库。

3.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述第一纯化和第三纯化的步骤相同，具体包括：加入磁珠后，在旋转仪上室温孵育18-22min获得孵育后体系；孵育结束后放置在磁力架上，弃去上清，加入480-520μL体积的70％乙醇，静置30-40s后缓慢旋转，使磁珠在管壁上移动，待溶液澄清后，去除上清液，再重复此步骤一次获得沉淀；再在所获得的沉淀中加入Low TE，用移液器上下吸打后振荡，离心后静置澄清获得上清液；其中，相对于100μL所述沉淀，Low TE的添加量为140-160μL。

4.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，第二纯化和第四纯化的步骤相同，具体包括：加入磁珠后，在旋转仪上室温孵育13-16min；孵育结束后放置在磁力架上，弃去上清，加入480-520μL体积的70％乙醇，静置30-40s后缓慢旋转，使磁珠在管壁上移动，待溶液澄清后，去除上清液，重复此步骤一次获得沉淀；再在所获得的沉淀中加入Low TE，用移液器上下吸打后振荡，离心后静置澄清获得上清液；其中，相对于100μL所述沉淀，Low TE的添加量为30-50μL。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所述的通用接头的退火体系为：100μM通用接头序列1 5μL；100μM通用接头序列2 5μL，5×Annealing Buffer 10μL，无核酸酶水30μL；退火程序为：加热至95℃，并以1℃/min的速度降温至25℃，25℃保温30min后于4℃保存；

条形码接头的退火体系为：100μM条形码接头序列1 5μL；100μM条形码接头序列2 5μL，5×Annealing Buffer 10μL，无核酸酶水30μL；反应程序为：95℃3min，以1℃/min的速度降温，直至降到25℃，25℃保温30min后于4℃保存。