[发明专利]快速监控混种酵母增殖的方法

说明书

技术领域

本发明属于检测方法，具体涉及酵母的检测方法，尤其涉及一种用于啤酒的混种酵母的增殖规律和混种比例的检测方法。

背景技术

啤酒是以大麦经发芽制成的大麦芽为主要原料，经糖化、添加酒花、啤酒酵母发酵酿制而成的，含二氧化碳、低酒精浓度的、起泡的酿造酒。酿造啤酒，实际上是将淀粉转换成被称为“麦汁”的含糖液体，再利用酵母将麦汁发酵成含有酒精的啤酒。啤酒发酵过程是啤酒酵母在一定的条件下，利用麦汁中的可发酵性物质而进行的正常生命活动，其代谢的产物就是所要的产品——啤酒。然而，普通的啤酒是利用纯种啤酒酵母将麦汁进行发酵制成的，口味较为单一，保健功能也有限。

为了提升啤酒的口感，研发人员使用混种酵母进行啤酒发酵的研究。要研究混种酵母发酵对于酿造啤酒的品质的影响，需要开发监控不同酵母的增殖规律和混种比例的变化。这将有助于了解混种发酵过程中不同酵母的生长曲线和增殖规律以及不同酵母之间的相互影响，从而进一步为调控混种比例和保持最佳发酵性能提供技术保证，然而，目前还没有这样一种检测方法。

发明内容

本发明提供了基于GeXP遗传分析系统(原理是毛细管电泳技术)平台的检测方法，用于啤酒的混种酵母的增殖规律和混种比例。

本发明的技术方案：

快速监控混种酵母增殖的方法，包括引物设计、PCR扩增反应、GeXP毛细管电泳检测、制作标准曲线、实时监控发酵液和优化混种酵母比例。具体检测步骤如下：

①引物设计：搜索Lager啤酒酵母基因组序列中的差异片段，并根据差异片段设计区分不同酵母的引物；每条引物分别配制成100μM的储存液，使用时稀释成200 nM的工作液；

②PCR扩增反应：分别用提取的纯种酵母DNA和步骤①设计的引物配制PCR反应体系，上PCR反应仪，扩增得到不同纯种酵母的特异产物，即为PCR产物，将PCR产物稀释50倍后待检；

③GeXP毛细管电泳检测：采用GeXP毛细管电泳检测稀释后的PCR产物并分析，确定纯种酵母的特征峰；具体步骤包括：

A.取DSS400(分子量内标-400)，加入80倍体积SLS(上样缓冲液，甲酰胺)，在涡旋震荡器上震荡30S，转移至上样板的孔中；

B.取0.6μl PCR产物稀释液加到分装有40μl的SLS和DSS混合液的上样板的孔中，用移液枪混匀后覆盖一滴石蜡油；

C.在缓冲液板的每个孔中加入250μl的分离缓冲液；

D.上机进行GeXP毛细管电泳检测(使用Freg-3分离方法)，利用GeXP系统参数对毛细管电泳结果进行分析，记录结果；

④制作标准曲线：(a)分别提取纯种酵母的DNA，检测核酸浓度并稀释至相同浓度，按不同体积比混合，即得到具备特征峰的纯种酵母的质量百分比依次为0、20％、40％、60％、80％、100％的混种酵母DNA；(b)对不同混合比例的混种酵母进行GeXP毛细管电泳检测，得到特征峰的峰高H_T以及两种酵母共有峰的峰高H_B；(c)根据混合比例和H_T/H_B比值，制作标准曲线；

⑤实时监控发酵液：提取混种发酵的酵母样品DNA，进行PCR反应，将稀释后的PCR产物进行GeXP毛细管电泳检测，得到检测样品的H_T/H_B比值，通过步骤④制作的标准曲线计算两种酵母的混合比例。

优选的是，所述两种纯种酵母为酵母L830和酵母L053，所述酵母L830的特征峰位于289bp，所述两种酵母的共有峰位于286bp。

优选的是，所述两种纯种酵母为酵母L830和酵母L820，所述酵母L830的特征峰位于289bp，所述两种酵母的共有峰位于286bp。

优选的是，所述两种纯种酵母为酵母L830和酵母WP3470，所述酵母L830的特征峰位于289bp，所述两种酵母的共有峰位于286bp。