[发明专利]快速监控混种酵母增殖的方法

权利要求书

1.快速监控混种酵母增殖的方法，其特征在于：包括引物设计、PCR扩增反应、GeXP毛细管电泳检测、制作标准曲线和实时监控发酵液；具体检测步骤如下：

①引物设计：搜索Lager啤酒酵母基因组序列中的差异片段，并根据差异片段设计区分不同酵母的引物；

②PCR扩增反应：分别用提取的纯种酵母DNA和步骤①设计的引物配制PCR反应体系，上PCR反应仪，扩增得到不同纯种酵母的特异产物，即为PCR产物；

③GeXP毛细管电泳检测：采用GeXP毛细管电泳检测稀释后的PCR产物并分析，确定纯种酵母的特征峰；

④制作标准曲线：(a)提取两种纯种酵母的DNA，将二者按照不同比例混合，得到不同混合比例的混种酵母DNA，所述混合比例为质量百分比；(b)对不同混合比例的混种酵母进行GeXP毛细管电泳检测，得到特征峰的峰高H_T以及两种酵母共有峰的峰高H_B；(c)根据混合比例和H_T/H_B比值，制作标准曲线；

⑤实时监控发酵液：对由步骤④的两种纯种酵母组成的混种发酵样品提取DNA，进行PCR反应，将稀释后的PCR产物进行GeXP毛细管电泳检测，得到检测样品的H_T/H_B比值，通过步骤④制作的标准曲线计算酵母中两种酵母的混合比例。

2.根据权利要求1所述的快速监控混种酵母增殖的技术，其特征在于：所述两种纯种酵母为酵母L830和酵母L053，所述酵母L830的特征峰位于289bp，所述两种酵母的共有峰位于286bp。

3.根据权利要求1所述的快速监控混种酵母增殖的技术，其特征在于：所述两种纯种酵母为酵母L830和酵母L820，所述酵母L830的特征峰位于289bp，所述两种酵母的共有峰位于286bp。

4.根据权利要求1所述的快速监控混种酵母增殖的技术，其特征在于：所述两种纯种酵母为酵母L830和酵母WP3470，所述酵母L830的特征峰位于289bp，所述两种酵母的共有峰位于286bp。

5.根据权利要求2-4中任意一项所述的快速监控混种酵母增殖的技术，其特征在于：所述步骤①中每条引物分别配制成100μM的储存液，使用时稀释成200nM的工作液；所述步骤④(a)为分别提取纯种酵母的DNA，检测核酸浓度并稀释至相同浓度，按不同体积比混合，即得到不同摩尔比的混种酵母DNA。

6.根据权利要求5所述的快速监控混种酵母增殖的技术，其特征在于：所述混种酵母中，具备特征峰的酵母的质量百分比依次为0、20％、40％、60％、80％、100％。

7.根据权利要求2-4中任意一项所述的快速监控混种酵母增殖的技术，其特征在于：所述GeXP毛细管电泳检测包括以下几个步骤：

①取DSS400，加入80倍体积SLS,在涡旋震荡器上震荡30S，转移入上样板的孔中；

②取0.6μl稀释后的PCR产物，加入装有40μlSLS-DSS混合液的上样板的孔中，用移液枪混匀后覆盖一滴石蜡油；

③在缓冲液板的每个孔中加入250μl的分离缓冲液；

④上机进行GeXP毛细管电泳检测并记录结果。