[发明专利]DNA芯片组合延伸检测碱基连续突变的方法

权利要求书

1.DNA芯片组合延伸检测碱基连续突变的方法，其特征在于已知一段核酸序列的待检样本中的至少一个单碱基的各种可能变化的确定是通过一个杂交到固定的样本核酸序列上的至少一个碱基延伸的组合检测来确定的，具体步骤为：

步骤1)扩增：利用包含一个5’端修饰活性基团的PCR引物，对待检样本进行平行扩增；

步骤2)DNA芯片及微阵列的制备：将不同待检样本的扩增产物经过浓缩后点样于能与上述PCR引物5’端修饰活性基团结合、经过修饰的玻璃片上，使不同待检样本的PCR产物的一条单链固定在玻璃片上，构建得到包含所有待检样本的一组DNA芯片或者一张芯片上的一组DNA微阵列；

步骤3)检测：根据检测位点所包含的可能信息，在不同的DNA芯片或者一张芯片的几个DNA微阵列进行延伸检测；a)在DNA芯片经过变性、并杂交测序引物后，进行包含荧光标记的核苷酸延伸，并记录所有样本该次延伸的结果；b)在DNA芯片经过变性、并杂交测序引物后，先用非标记的核苷酸延伸到需要检测的碱基位置，然后进行包含荧光标记的核苷酸延伸，并记录所有样本该次延伸的结果；c)根据需要，变换不同的非标记、标记的核苷酸延伸方式，按照步骤b)的方式实施检测；最后，将所有检测中不同样本的信息集合，从而实现多样本中一个或者多个单碱基的各种可能变化的检测。

2.根据权利要求1所述的DNA芯片组合延伸检测碱基连续突变的方法，其特征在于荧光单体为不同荧光染料标记不同的dNTP单体或者ddNTP。

3.根据权利要求1所述的DNA芯片组合延伸检测碱基连续突变的方法，其特征在于所述PCR引物5’端修饰的活性基团是在热条件下稳定的氨基、生物素或丙烯酰胺，所述玻璃片的修饰基团分别为醛基、羧基、亲和素或丙烯。

4.一种DNA芯片组合延伸检测多单样Kras基因12、13密码子突变的方法，其特征在于步骤为：

(1)将所有需检测的样本处理后提取DNA用作扩增模板；

(2)用一对PCR引物分别将所有样本中待检测的包含Kras基因12、13密码子的序列进行PCR扩增，其中上游引物：5’-CGTCTGCAGTCAACTGGAATT；下游引物：5’-NH₂-TTTTTTTTT CCTGACATACTCCCAAGGAAA；

(3)将PCR产物用异丙醇沉淀，并用乙醇洗涤2次后干燥除去乙醇；

(4)用pH＝9碳酸缓冲液溶解所有样本PCR产物，充分溶解的PCR产物用于点样制作三张相同的DNA芯片，点样时记录样本在DNA芯片上的位置编码，同一DNA芯片上每个样本DNA芯片上只有一个阵点，或有多个重复；

(5)各加入2uM的延伸引物5’-TTTGAACACCATCAACCTCGA分别与三张芯片杂交；

(6)在第一张DNA芯片上加入1uM Cy5-dTTP和1uM Cy3-dGTP的延伸反应液，进行延伸反应；延伸反应完成后，再加入1uM Cy5-dATP的延伸反应液进行延伸反应；在第二张DNA芯片上加入含有2uM dCTP的延伸反应液，延伸反应完成后，洗去未参与延伸反应的dCTP，然后加入含有0.1uM/1uM的dGTP/Cy3-dGTP和0.1uM/1uM的dATP/Cy5-dATP的延伸反应液，进行延伸反应；在第三张DNA芯片上加入含有2uM dCTP和2uM dATP的延伸反应液，延伸反应完成后，洗去未参与延伸反应的dCTP和dATP，然后加入含有0.1uM/1uM的dTTP/Cy5-dTTP和0.1uM/1uM的dGTP/Cy3-dGTP的延伸反应液，进行延伸反应；

(7)反应结束后，洗去未参与延伸反应的标记物，然后扫描，并记录三张DNA芯片上每个位置Cy5和Cy3荧光的信号强度；根据第一、第二和第三张芯片扫描的结果，确定DNA芯片上每个阵点样本的DNA序列，实现所有样本Kras基因12、13密码子序列的检测：

阵点在第一、第二张芯片扫描无明显的荧光信号，第三张芯片扫描具有Cy5信号，则序列为GAT GGC；

阵点在第一芯片扫描无明显的荧光信号，第二张芯片扫描同时具有Cy5和Cy3信号，第三张芯片扫描具有Cy3信号，则序列为GCT GGC；

阵点在第一芯片扫描无明显的荧光信号，第二张芯片扫描同时具有Cy5信号，第三张芯片扫描具有Cy3信号，且Cy5信号的强度大约是Cy3信号强度的2倍，则序列为GTT GGC；

阵点在第一芯片、第三张芯片扫描具有Cy5信号荧光信号，第二张芯片扫描无明显荧光信号，则序列为AGT GGC；

阵点在第一、第二张、第三张芯片扫描均具有Cy3信号，则序列为CGT GGC；

阵点在第一、第二芯片扫描均具有Cy5的荧光信号，第三张芯片扫描具有Cy3信号，则序列为TGT GGC；

阵点在第一芯片扫描无明显的荧光信号，第三张芯片扫描具有Cy5的信号，第三张芯片扫描具有Cy5信号，则序列为GGT GAC；

阵点在第一张芯片扫描无明显的荧光信号，第二芯片扫描均具有Cy5的荧光信号，第三张芯片扫描具有Cy3的信号，则序列为GGT GGC。